Síntesis de oligonucleótidos

Síntesis química de fragmentos relativamente cortos de ácidos nucleicos con estructura química definida.

La síntesis de oligonucleótidos es la síntesis química de fragmentos relativamente cortos de ácidos nucleicos con una estructura química definida ( secuencia ). La técnica es extremadamente útil en la práctica de laboratorio actual porque proporciona un acceso rápido y económico a oligonucleótidos personalizados de la secuencia deseada. Mientras que las enzimas sintetizan ADN y ARN sólo en la dirección 5' a 3' , la síntesis química de oligonucleótidos no tiene esta limitación, aunque la mayoría de las veces se lleva a cabo en la dirección opuesta, 3' a 5'. Actualmente, el proceso se implementa como síntesis en fase sólida utilizando el método de la fosforamidita y bloques de construcción de fosforamidita derivados de 2'-desoxinucleósidos protegidos ( dA , dC , dG y T ), ribonucleósidos ( A , C , G y U ) o químicamente. nucleósidos modificados, por ejemplo LNA o BNA .

Para obtener el oligonucleótido deseado, los componentes básicos se acoplan secuencialmente a la cadena de oligonucleótidos en crecimiento en el orden requerido por la secuencia del producto (consulte el ciclo sintético a continuación). El proceso ha estado completamente automatizado desde finales de los años 1970. Una vez completado el ensamblaje de la cadena, el producto se libera de la fase sólida a la solución, se desprotege y se recoge. La aparición de reacciones secundarias establece límites prácticos para la longitud de los oligonucleótidos sintéticos (hasta aproximadamente 200 residuos de nucleótidos ) porque el número de errores se acumula con la longitud del oligonucleótido que se sintetiza. ^[1] Los productos a menudo se aíslan mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para obtener los oligonucleótidos deseados con alta pureza. Normalmente, los oligonucleótidos sintéticos son moléculas de ADN o ARN monocatenarias de entre 15 y 25 bases de longitud.

Los oligonucleótidos encuentran una variedad de aplicaciones en biología molecular y medicina. Se utilizan más comúnmente como oligonucleótidos antisentido , pequeños ARN de interferencia , cebadores para la secuenciación y amplificación del ADN , sondas para detectar ADN o ARN complementario mediante hibridación molecular , herramientas para la introducción selectiva de mutaciones y sitios de restricción , y para la síntesis de genes artificiales . Una aplicación emergente de la síntesis de oligonucleótidos es la recreación de virus a partir únicamente de una secuencia, ya sea inofensivos, como Phi X 174 , o peligrosos, como el virus de la influenza de 1917 o el SARS-CoV-2 .

Historia

La evolución de la síntesis de oligonucleótidos vio cuatro métodos principales de formación de enlaces internucleosídicos y ha sido revisada en la literatura con gran detalle. ^{[2] [3] [4]}

Trabajos iniciales y síntesis contemporánea de H-fosfonato.

Esquema. 1. i : N -clorosuccinimida; Bn = _-CH2Ph

A principios de la década de 1950, el grupo de Alexander Todd fue pionero en los métodos de síntesis de oligonucleótidos con H-fosfonato y triéster de fosfato . ^{[5] [6]} La reacción de los compuestos 1 y 2 para formar H-fosfonato diéster 3 es un acoplamiento de H-fosfonato en solución, mientras que la de los compuestos 4 y 5 para dar 6 es un acoplamiento de fosfotriéster (consulte la síntesis de fosfotriéster a continuación).

Esquema 2. Síntesis de oligonucleótidos por el Método H-Fosfonato

Treinta años después, este trabajo inspiró, de forma independiente, a dos grupos de investigación a adoptar la química del H-fosfonato para la síntesis en fase sólida utilizando monoésteres de nucleósido H-fosfonato 7 como componentes básicos y cloruro de pivaloilo, cloruro de 2,4,6-triisopropilbencenosulfonilo (TPS -Cl), y otros compuestos como activadores. ^{[7] [8]} La implementación práctica del método del H-fosfonato dio como resultado un ciclo sintético muy corto y simple que consta de solo dos pasos, detritilación y acoplamiento (Esquema 2). La oxidación de los enlaces diéster de H-fosfonato internucleosídicos en 8 a enlaces fosfodiéster en 9 con una solución de yodo en piridina acuosa se lleva a cabo al final del ensamblaje de la cadena en lugar de como un paso en el ciclo sintético. Si se desea, la oxidación puede llevarse a cabo en condiciones anhidras. ^[9] Alternativamente, 8 se puede convertir en fosforotioato 10 ^{[10] [11] [12] [13]} o fosforoselenoato 11 (X = Se), ^[14] u oxidarse con CCl ₄ en presencia de aminas primarias o secundarias para análogos de fosforamidato 12 . ^{[15] [16]} El método es muy conveniente porque se pueden introducir varios tipos de modificaciones de fosfato (fosfato/fosforotioato/fosforamidato) en el mismo oligonucleótido para modular sus propiedades. ^{[17] [18] [19]}

Muy a menudo, los bloques de construcción de H-fosfonato están protegidos en el grupo 5'-hidroxi y en el grupo amino de las bases nucleicas A, C y G de la misma manera que los bloques de construcción de fosforamidita (ver más abajo). Sin embargo, la protección del grupo amino no es obligatoria. ^{[9] [20]}

Síntesis de fosfodiéster

Esquema. 3 Acoplamiento de oligonucleótidos mediante el método del fosfodiéster; Tr = -CPh ₃

En la década de 1950, Har Gobind Khorana y sus colaboradores desarrollaron un método de fosfodiéster en el que se activaba 3'- O- acetilnucleósido-5'- O -fosfato 2 (Esquema 3) con N , N' - diciclohexilcarbodiimida (DCC) o 4-toluenosulfonil. cloruro (Ts-Cl). Las especies activadas se hicieron reaccionar con un nucleósido 1 protegido en 5'- O para dar un monofosfato de dinucleósido protegido 3 . ^[21] Tras la eliminación del grupo 3'- O- acetilo mediante hidrólisis catalizada por bases, se llevó a cabo un mayor alargamiento de la cadena. Siguiendo esta metodología, se sintetizaron conjuntos de tri y tetradesoxirribonucleótidos que se convirtieron enzimáticamente en oligonucleótidos más largos, lo que permitió dilucidar el código genético . La principal limitación del método del fosfodiéster consistió en la formación de oligómeros de pirofosfato y oligonucleótidos ramificados en el fosfato internucleosídico. El método parece estar un paso atrás respecto de la química más selectiva descrita anteriormente; sin embargo, en ese momento, la mayoría de los grupos protectores de fosfato disponibles en la actualidad aún no se habían introducido. La falta de una estrategia de protección conveniente obligó a recurrir a una química más lenta y menos selectiva para lograr el objetivo final del estudio. ^[2]

Síntesis de fosfotriéster

Esquema 4. Acoplamiento de oligonucleótidos por método de fosfotriéster; MMT = -CPh2 ₍ 4 - _{MeOC6H4 )} .

En la década de 1960, los grupos liderados por R. Letsinger ^[22] y C. Reese ^[23] desarrollaron un enfoque de fosfotriéster. La diferencia definitoria con respecto al enfoque del fosfodiéster fue la protección del resto fosfato en el componente básico 1 (Esquema 4) y en el producto 3 con el grupo 2-cianoetilo . Esto impidió la formación de oligonucleótidos ramificados en el fosfato internucleosídico. La mayor selectividad del método permitió el uso de catalizadores y agentes de acoplamiento más eficientes, ^{[24] [25],} lo que redujo drásticamente la duración de la síntesis. El método, inicialmente desarrollado para la síntesis en fase de solución, también se implementó en poliestireno "palomitas" de baja reticulación, ^[26] y más tarde en vidrio de poro controlado (CPG, ver "Material de soporte sólido" a continuación), lo que inició un esfuerzo de investigación masivo en la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida y finalmente condujo a la automatización del ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos.

Síntesis de triéster de fosfito.

En la década de 1970, se utilizaron con éxito derivados de nucleósidos P(III) sustancialmente más reactivos, los 3'- O- clorofosfitos, para la formación de enlaces internucleosídicos. ^[27] Esto llevó al descubrimiento de la metodología del triéster de fosfito . El grupo dirigido por M. Caruthers aprovechó 1H -tetrazolidofosfitos menos agresivos y más selectivos e implementó el método en fase sólida. ^[28] Muy poco después, los trabajadores del mismo grupo mejoraron aún más el método utilizando fosforamiditas de nucleósidos más estables como componentes básicos. ^[29] El uso de un grupo protector de fosfito de 2-cianoetilo ^[30] en lugar de un grupo metilo menos fácil de usar ^{[31] [32]} condujo a las fosforamiditas de nucleósidos que se utilizan actualmente en la síntesis de oligonucleótidos (consulte los componentes básicos de fosforamidita a continuación). Muchas mejoras posteriores en la fabricación de bloques de construcción, sintetizadores de oligonucleótidos y protocolos sintéticos hicieron de la química de la fosforamidita un método de elección muy confiable y conveniente para la preparación de oligonucleótidos sintéticos. ^[1]

Síntesis por el método de la fosforamidita.

Bloques de construcción

Fosforamiditas de nucleósidos

Fosforamiditas de 2'-desoxinucleósidos protegidas.

Como se mencionó anteriormente, los nucleótidos naturales (nucleósidos-3'- o 5'-fosfatos) y sus análogos fosfodiéster no son suficientemente reactivos para proporcionar una preparación sintética rápida de oligonucleótidos con altos rendimientos. La selectividad y la velocidad de formación de enlaces internucleosídicos mejoran drásticamente mediante el uso de derivados 3'- O- ( N , N -diisopropilfosforamidita) de nucleósidos (fosforamiditas de nucleósidos) que sirven como componentes básicos en la metodología del triéster de fosfito. Para evitar reacciones secundarias no deseadas, todos los demás grupos funcionales presentes en los nucleósidos deben dejarse no reactivos (protegidos) mediante la unión de grupos protectores . Una vez completado el ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos, se eliminan todos los grupos protectores para producir los oligonucleótidos deseados. A continuación, se revisan brevemente los grupos protectores utilizados actualmente en los bloques de construcción de nucleósidos fosforamidita disponibles comercialmente ^{[33] [34] [35] [36] :}

• El grupo 5'-hidroxilo está protegido por un grupo DMT (4,4'-dimetoxitritilo) lábil a los ácidos .
• La timina y el uracilo , bases nucleicas de la timidina y la uridina , respectivamente, no tienen grupos amino exocíclicos y, por tanto, no requieren ninguna protección.
• Aunque la base nucleica de guanosina y 2'-desoxiguanosina tiene un grupo amino exocíclico, su basicidad es baja hasta el punto de que no reacciona con fosforamiditas en las condiciones de la reacción de acoplamiento. Sin embargo, una fosforamidita derivada de la 5'- O -DMT-2'-desoxiguanosina desprotegida con N2 es poco soluble en acetonitrilo , el disolvente comúnmente utilizado en la síntesis de oligonucleótidos. ^[37] Por el contrario, las versiones protegidas con N2 del mismo compuesto se disuelven bien en acetonitrilo y, por lo tanto, se utilizan ampliamente. Las bases nucleicas adenina y citosina llevan grupos amino exocíclicos que reaccionan con las fosforamiditas activadas en las condiciones de la reacción de acoplamiento. Mediante el uso de pasos adicionales en el ciclo sintético ^{[38] [39]} o agentes de acoplamiento y sistemas disolventes alternativos, ^[37] el ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos se puede llevar a cabo utilizando fosforamiditas dA y dC con grupos amino desprotegidos. Sin embargo, estos enfoques permanecen actualmente en la etapa de investigación. En la síntesis rutinaria de oligonucleótidos, los grupos amino exocíclicos de los nucleósidos se mantienen permanentemente protegidos en toda la longitud del conjunto de la cadena de oligonucleótidos.

La protección de los grupos amino exocíclicos tiene que ser ortogonal a la del grupo 5'-hidroxi porque este último se elimina al final de cada ciclo sintético. La estrategia más sencilla de implementar y, por tanto, la más utilizada, es instalar un grupo protector lábil a las bases en los grupos amino exocíclicos. La mayoría de las veces se utilizan dos esquemas de protección.

• En el primero, el esquema estándar y más robusto (Figura), se utiliza protección Bz (benzoílo) para A, dA, C y dC, mientras que G y dG están protegidos con un grupo isobutirilo. Más recientemente, el grupo Ac (acetilo) se utiliza para proteger C y dC como se muestra en la Figura. ^[40]
• En el segundo esquema de protección suave, A y dA están protegidos con grupos isobutirilo ^[41] o fenoxiacetilo (PAC). ^[42] C y dC llevan protección acetilo, ^[40] y G y dG están protegidos con grupos 4-isopropilfenoxiacetilo ( i Pr-PAC) ^[43] o dimetilformamidino (dmf) ^[44] . Los grupos protectores suaves se eliminan más fácilmente que los grupos protectores estándar. Sin embargo, las fosforamiditas que contienen estos grupos son menos estables cuando se almacenan en solución.
• El grupo fosfito está protegido por un grupo protector 2-cianoetilo lábil a bases . ^[30] Una vez que se ha acoplado una fosforamidita al oligonucleótido unido a un soporte sólido y los restos de fosfito se han convertido en la especie P(V), la presencia de la protección de fosfato no es obligatoria para la realización exitosa de reacciones de acoplamiento adicionales. ^[45]

Fosforamiditas de ribonucleósidos protegidas con 2'- O .

• En la síntesis de ARN, el grupo 2'-hidroxi está protegido con el grupo TBDMS ( t -butildimetilsililo). ^{[46] [47] [48] [49]} o con el grupo TOM ( triisopropilsililoximetilo ), ^{[50] [51]} siendo ambos eliminables mediante tratamiento con ion fluoruro.
• El resto fosfito también lleva un grupo diisopropilamino ( i Pr ₂ N) reactivo en condiciones ácidas. Tras la activación, el grupo diisopropilamino deja de ser sustituido por el grupo 5'-hidroxi del oligonucleótido unido al soporte (consulte el "Paso 2: Acoplamiento" a continuación).

Fosforamiditas no nucleósidas

Fosforamiditas no nucleósidas para la modificación 5' de oligonucleótidos sintéticos. MMT = monometoxitritilo, (4metoxifenil)difenilmetilo.

Las fosforamiditas no nucleósidas son reactivos de fosforamidita diseñados para introducir diversas funcionalidades en los extremos de oligonucleótidos sintéticos o entre residuos de nucleótidos en el medio de la secuencia. Para introducirse dentro de la secuencia, un modificador no nucleosídico debe poseer al menos dos grupos hidroxi, uno de los cuales suele estar protegido con el grupo DMT mientras que el otro lleva el resto fosforamidita reactivo. ^{[ cita necesaria ]}

Las fosforamiditas no nucleosídicas se utilizan para introducir grupos deseados que no están disponibles en los nucleósidos naturales o que pueden introducirse más fácilmente utilizando diseños químicos más simples. En el esquema se muestra una selección muy breve de reactivos de fosforamidita comerciales para demostrar la diversidad estructural y funcional disponible. Estos reactivos sirven para la unión de fosfato 5'-terminal ( 1 ), ^[52] NH ₂ ( 2 ), ^[53] SH ( 3 ), ^[54] aldehído ( 4 ), ^[55] y grupos carboxílicos ( 5 ) , ^[56] Triples enlaces CC ( 6 ), ^[57] marcadores no radiactivos y extintores (ejemplificados por 6-FAM amidita 7 ^[58] para la unión de fluoresceína y dabcil amidita 8 , ^[59] respectivamente), hidrofílicos e hidrofóbicos. modificadores (ejemplificados por amidita de hexaetilenglicol 9 ^{[60] [61]} y amidita de colesterol 10 , ^[62] respectivamente) y amidita de biotina 11 . ^[63]

Ciclo de síntesis

Esquema 5. Ciclo de síntesis para la preparación de oligonucleótidos por el método de la fosforamidita.

La síntesis de oligonucleótidos se lleva a cabo mediante la adición gradual de residuos de nucleótidos al extremo 5' de la cadena en crecimiento hasta que se ensambla la secuencia deseada. Cada adición se denomina ciclo de síntesis (Esquema 5) y consta de cuatro reacciones químicas:

Paso 1: Desbloqueo (destritilación)

El grupo DMT se elimina con una solución de un ácido, como ácido tricloroacético (TCA) al 2% o ácido dicloroacético (DCA) al 3%, en un disolvente inerte ( diclorometano o tolueno ). El catión DMT de color naranja formado se elimina por lavado; la etapa da como resultado que el precursor de oligonucleótido unido a un soporte sólido lleve un grupo hidroxilo 5'-terminal libre. Vale la pena recordar que realizar la detritilación durante un tiempo prolongado o con soluciones de ácidos más fuertes que las recomendadas conduce a la despurinación del oligonucleótido unido al soporte sólido y, por lo tanto, reduce el rendimiento del producto de longitud completa deseado. ^{[ cita necesaria ]}

Paso 2: Acoplamiento

Una solución de 0,02 a 0,2 M de fosforamidita de nucleósido (o una mezcla de varias fosforamiditas) en acetonitrilo se activa mediante una solución de 0,2 a 0,7 M de un catalizador de azol ácido, 1 H -tetrazol , 5-etiltio-1H-tetrazol, ^[64] 2-benciltiotetrazol, ^{[65] [66]} 4,5- dicianoimidazol , ^[67] o varios compuestos similares. En una revisión reciente se puede encontrar información más extensa sobre el uso de diversos agentes de acoplamiento en la síntesis de oligonucleótidos. ^[68] La mezcla suele ser muy breve y se produce en líneas fluidas de sintetizadores de oligonucleótidos (ver más abajo) mientras los componentes se entregan a los reactores que contienen soporte sólido. La fosforamidita activada en un exceso de 1,5 a 20 veces sobre el material unido al soporte se pone en contacto con el soporte sólido inicial (primer acoplamiento) o un precursor de oligonucleótido unido al soporte (después de los acoplamientos) cuyo grupo 5'-hidroxi reacciona con el resto fosforamidita activado del nucleósido fosforamidito entrante para formar un enlace triéster fosfito. El acoplamiento de fosforamiditas de 2'-desoxinucleósidos es muy rápido y requiere, a pequeña escala, unos 20 s para completarse. Por el contrario, las fosforamiditas de ribonucleósidos protegidas con 2'- O estéricamente impedidas requieren de 5 a 15 minutos para acoplarse con altos rendimientos. ^{[47] [69] [70] [71]} La reacción también es muy sensible a la presencia de agua, particularmente cuando se utilizan soluciones diluidas de fosforamiditas, y comúnmente se lleva a cabo en acetonitrilo anhidro. Generalmente, cuanto mayor es la escala de la síntesis, menor es el exceso y mayor es la concentración de las fosforamiditas. Por el contrario, la concentración del activador está determinada principalmente por su solubilidad en acetonitrilo y es independiente de la escala de la síntesis. Una vez completado el acoplamiento, todos los reactivos y subproductos no unidos se eliminan mediante lavado.

Paso 3: tapar

La etapa de protección se realiza tratando el material unido al soporte sólido con una mezcla de anhídrido acético y 1-metilimidazol o, con menos frecuencia, DMAP como catalizadores y, en el método de la fosforamidita, tiene dos propósitos.

• Después de completar la reacción de acoplamiento, un pequeño porcentaje de los grupos 5'-OH unidos al soporte sólido (0,1 a 1%) permanece sin reaccionar y necesita ser bloqueado permanentemente para evitar un mayor alargamiento de la cadena para evitar la formación de oligonucleótidos con una base interna. eliminación comúnmente conocida como (n-1) acortadores. Los grupos 5'-hidroxi que no han reaccionado son acetilados en gran medida por la mezcla de protección.
• También se ha informado que las fosforamiditas activadas con 1H - tetrazol reaccionan, en pequeña medida, con la posición O ^{6 de la guanosina. [72]} Tras la oxidación con I ₂ /agua, este subproducto, posiblemente a través de la migración de O ⁶ -N7, sufre depurinación . Los sitios apurínicos así formados se escinden fácilmente en el curso de la desprotección final del oligonucleótido en las condiciones básicas (ver más abajo) para dar dos oligonucleótidos más cortos, reduciendo así el rendimiento del producto de longitud completa. Las modificaciones de O ⁶ se eliminan rápidamente mediante tratamiento con el reactivo de protección siempre que la etapa de protección se realice antes de la oxidación con I ₂ /agua.
• La síntesis de oligonucleótidos fosforotioatos (OPS, ver más abajo) no implica oxidación con I ₂ /agua y, respectivamente, no sufre la reacción secundaria descrita anteriormente. Por otro lado, si la etapa de protección se realiza antes de la sulfuración, el soporte sólido puede contener el anhídrido acético residual y el N-metilimidazol que quedan después de la etapa de protección. La mezcla de protección interfiere con la reacción de transferencia de azufre, lo que da como resultado la formación extensa de enlaces internucleosídicos triéster de fosfato en lugar de los triésteres de PS deseados. Por lo tanto, para la síntesis de OPS, es aconsejable realizar el paso de sulfuración antes del paso de tapado. ^[73]

Paso 4: oxidación

El enlace triéster de fosfito tricoordinado recién formado no es natural y tiene una estabilidad limitada en las condiciones de síntesis de oligonucleótidos. El tratamiento del material unido al soporte con yodo y agua en presencia de una base débil (piridina, lutidina o colidina ) oxida el triéster de fosfito en un triéster de fosfato tetracoordinado, un precursor protegido del enlace internucleosídico del diéster de fosfato natural. La oxidación se puede llevar a cabo en condiciones anhidras utilizando hidroperóxido de terc-butilo ^[74] o, más eficientemente, (1S)-(+)-(10-canforsulfonil)-oxaziridina (CSO). ^{[75] [76] [77]} El paso de oxidación se puede sustituir por un paso de sulfuración para obtener oligonucleótidos fosforotioatos (consulte Oligonucleótidos fosforotioatos y su síntesis a continuación). En el último caso, la etapa de sulfuración se lleva a cabo mejor antes del taponado.

Soportes sólidos

En la síntesis en fase sólida, un oligonucleótido que se ensambla se une covalentemente , a través de su grupo hidroxi 3'-terminal, a un material de soporte sólido y permanece unido a él durante todo el curso del ensamblaje de la cadena. El soporte sólido está contenido en columnas cuyas dimensiones dependen de la escala de síntesis y pueden variar entre 0,05  ml y varios litros. La inmensa mayoría de los oligonucleótidos se sintetizan a pequeña escala, desde 10 n mol hasta 1 μmol. Más recientemente, la síntesis de oligonucleótidos de alto rendimiento en la que el soporte sólido está contenido en los pocillos de placas de varios pocillos (la mayoría de las veces, 96 o 384 pocillos por placa) se convirtió en un método de elección para la síntesis paralela de oligonucleótidos a pequeña escala. ^[78] Al final del ensamblaje de la cadena, el oligonucleótido se libera del soporte sólido y se eluye de la columna o del pocillo.

Material de soporte sólido

A diferencia de la síntesis orgánica en fase sólida y la síntesis de péptidos , la síntesis de oligonucleótidos se desarrolla mejor en soportes sólidos no hinchables o poco hinchables. Los dos materiales de fase sólida más utilizados son el vidrio de poro controlado (CPG) y el poliestireno macroporoso (MPPS). ^[79]

• El CPG se define comúnmente por el tamaño de sus poros. En química de oligonucleótidos, se utilizan tamaños de poro de 500, 1000, 1500, 2000 y 3000  Å para permitir la preparación de aproximadamente 50, 80, 100, 150 y 200 oligonucleótidos, respectivamente. Para hacer que el CPG nativo sea adecuado para su posterior procesamiento, la superficie del material se trata con (3-aminopropil)trietoxisilano para dar aminopropil CPG. El brazo aminopropilo puede extenderse aún más para dar como resultado CPG aminoalquilo de cadena larga (LCAA). Luego, el grupo amino se utiliza como punto de anclaje para conectores adecuados para la síntesis de oligonucleótidos (ver más abajo).
• El MPPS adecuado para la síntesis de oligonucleótidos es un poliestireno altamente reticulado y poco hinchable obtenido por polimerización de divinilbenceno (mínimo 60%), estireno y 4- clorometilestireno en presencia de un agente porógeno. El clorometil MPPS macroporoso obtenido se convierte en aminometil MPPS.

Química del enlazador

Soportes sólidos comerciales para síntesis de oligonucleótidos.

Esquema 6. Mecanismo de 3'-desfosforilación de oligonucleótidos ensamblados sobre soportes sólidos universales.

Para hacer que el material de soporte sólido sea adecuado para la síntesis de oligonucleótidos, se unen covalentemente conectores no nucleosídicos o succinatos de nucleósidos a los grupos amino reactivos en aminopropil CPG, LCAA CPG o aminometil MPPS. Los grupos amino restantes que no han reaccionado se cubren con anhídrido acético . Normalmente se utilizan tres grupos conceptualmente diferentes de soportes sólidos.

• Soportes universales . En un método más reciente, más conveniente y más ampliamente utilizado, la síntesis comienza con el soporte universal donde se une un conector no nucleosídico al material de soporte sólido (compuestos 1 y 2 ). Una fosforamidita respectiva del residuo de nucleósido 3'-terminal se acopla al soporte sólido universal en el primer ciclo sintético del ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos usando los protocolos estándar. Luego se continúa el ensamblaje de la cadena hasta su finalización, después de lo cual se desprotege el oligonucleótido unido al soporte sólido. El rasgo característico de los soportes sólidos universales es que la liberación de los oligonucleótidos se produce mediante la escisión hidrolítica de un enlace PO que une el 3'- O del residuo de nucleótido 3'-terminal al conector universal como se muestra en el Esquema 6. La ventaja crítica de este enfoque es que se utiliza el mismo soporte sólido independientemente de la secuencia del oligonucleótido que se va a sintetizar. Para la eliminación completa del conector y el fosfato 3'-terminal del oligonucleótido ensamblado, el soporte sólido 1 y varios soportes sólidos similares ^[80] requieren amoníaco gaseoso, ^[81] hidróxido de amonio acuoso, metilamina acuosa, ^[82] o sus mezcla ^[83] y están disponibles comercialmente. ^{[84] [85]} El soporte sólido 2 ^[86] requiere una solución de amoníaco en metanol anhidro y también está disponible comercialmente. ^{[87] [88]}
• Soportes sólidos nucleosídicos . En un enfoque históricamente primero y todavía popular, el grupo 3'-hidroxi del residuo de nucleósido 3'-terminal se une al soporte sólido a través, más a menudo, del brazo 3'- O -succinilo como en el compuesto 3 . El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos comienza con el acoplamiento de un bloque de construcción de fosforamidita respectivo al residuo de nucleótido segundo desde el extremo 3'. El grupo hidroxi 3'-terminal en oligonucleótidos sintetizados sobre soportes sólidos nucleosídicos se desprotege en condiciones algo más suaves que las aplicables para soportes sólidos universales. Sin embargo, el hecho de que un soporte sólido nucleosídico deba seleccionarse de una manera específica de secuencia reduce el rendimiento de todo el proceso sintético y aumenta la probabilidad de error humano.
• Se utilizan soportes sólidos especiales para la unión de grupos funcionales o indicadores deseados en el extremo 3' de oligonucleótidos sintéticos. Por ejemplo, el soporte sólido comercial ^[89] 4 ^[90] permite la preparación de oligonucleótidos que llevan un conector 3-aminopropilo en el extremo 3'. De manera similar a las fosforamiditas no nucleosídicas, se encuentran disponibles comercialmente muchos otros soportes sólidos especiales diseñados para la unión de grupos funcionales reactivos, grupos indicadores no radiactivos y modificadores terminales ( por ejemplo, colesterol u otras uniones hidrófobas) y adecuados para diversas aplicaciones. En una revisión reciente se puede encontrar información más detallada sobre diversos soportes sólidos para la síntesis de oligonucleótidos. ^[78]

Fosforotioatos de oligonucleótidos y su síntesis.

S _p y R _p -enlaces fosforotioato internucleosídicos diastereoméricos.

Los oligonucleótidos fosforotioatos (OPS) son oligonucleótidos modificados en los que uno de los átomos de oxígeno de la fracción fosfato se reemplaza por azufre. Sólo los fosforotioatos que tienen azufre en una posición sin puente, como se muestra en la figura, se utilizan ampliamente y están disponibles comercialmente. La sustitución del oxígeno que no forma puentes con azufre crea un nuevo centro de quiralidad en el fósforo . En el caso simple de un dinucleótido, esto da como resultado la formación de un par diastereomérico de monofosforotioatos de dinucleósidos Sp y R p cuyas estructuras se muestran en _la figura _. En un oligonucleótido n -mero donde todos ( n  – 1) enlaces internucleosídicos son enlaces fosforotioato, el número de diastereómeros m se calcula como m = 2 ^{( n  – 1)} . Al ser análogos no naturales de los ácidos nucleicos, los OPS son sustancialmente más estables frente a la hidrólisis por nucleasas , la clase de enzimas que destruyen los ácidos nucleicos al romper el enlace PO puente del resto fosfodiéster. Esta propiedad determina el uso de OPS como oligonucleótidos antisentido en aplicaciones in vitro e in vivo donde la exposición extensa a nucleasas es inevitable. De manera similar, para mejorar la estabilidad del ARNip , a menudo se introduce al menos un enlace fosforotioato en el extremo 3' de las cadenas sentido y antisentido. En OPS quiralmente puro, los diastereómeros totalmente Sp son más estables a la degradación enzimática que sus análogos totalmente Rp. ^[91] Sin embargo, la preparación de OPS quiralmente puro sigue siendo un desafío sintético. ^{[13] [92]} En la práctica de laboratorio, se utilizan comúnmente mezclas de diastereómeros de OPS.

La síntesis de OPS es muy similar a la de los oligonucleótidos naturales. La diferencia es que el paso de oxidación se reemplaza por una reacción de transferencia de azufre (sulfurización) y que el paso de protección se realiza después de la sulfuración. De muchos reactivos reportados capaces de realizar una transferencia eficiente de azufre, solo tres están disponibles comercialmente:

Agentes comerciales de transferencia de azufre para la síntesis de oligonucleótidos.

• 3-(Dimetilaminometiliden)amino-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona, DDTT ( 3 ) proporciona una cinética rápida de sulfuración y una alta estabilidad en solución. ^{[73] [93] [94]} El reactivo está disponible en varias fuentes. ^{[95] [96]}
• 3 H -1,2-benzoditiol-3-ona 1,1-dióxido ( 4 ) ^{[97] [98],} también conocido como reactivo de Beaucage, muestra una mejor solubilidad en acetonitrilo y tiempos de reacción cortos. Sin embargo, el reactivo tiene una estabilidad limitada en solución y es menos eficaz para sulfurar los enlaces de ARN. ^{[93] [94]}
• El disulfuro de N,N,N'N'- tetraetiltiuram (TETD) es soluble en acetonitrilo y está disponible comercialmente. ^[99] Sin embargo, la reacción de sulfuración de un enlace de ADN internucleosídico con TETD requiere 15 minutos, ^[100] que es más de 10 veces más lenta que la de los compuestos 3 y 4 .

Automatización

En el pasado, la síntesis de oligonucleótidos se realizaba manualmente en solución o en fase sólida. La síntesis en fase sólida se implementó utilizando, como recipientes para la fase sólida, columnas de vidrio en miniatura similares en su forma a columnas de cromatografía de baja presión o jeringas equipadas con filtros porosos. ^[101] Actualmente, la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida se lleva a cabo automáticamente utilizando instrumentos controlados por computadora (sintetizadores de oligonucleótidos) y técnicamente se implementa en formatos de columna, placa de múltiples pocillos y matriz. El formato de columna es más adecuado para investigaciones y aplicaciones a gran escala donde no se requiere un alto rendimiento. ^[102] El formato de placa multipocillo está diseñado específicamente para la síntesis de alto rendimiento a pequeña escala para satisfacer la creciente demanda de oligonucleótidos sintéticos de la industria y el mundo académico. ^[103]

Historia de la síntesis de oligonucleótidos a mediana y gran escala.

Los sintetizadores de oligonucleótidos a gran escala se desarrollaron a menudo aumentando las capacidades de una plataforma de instrumentos preexistente. Uno de los primeros sintetizadores de escala media apareció a finales de la década de 1980, fabricado por la empresa Biosearch en Novato, CA (el 8800). Esta plataforma se diseñó originalmente como un sintetizador de péptidos y utilizó un reactor de lecho fluidizado esencial para adaptarse a las características de hinchamiento de los soportes de poliestireno utilizados en la metodología Merrifield. La síntesis de oligonucleótidos implicó el uso de CPG (vidrio de poro controlado), que es un soporte rígido y es más adecuado para reactores de columna como se describió anteriormente. La escala del 8800 se limitó al caudal requerido para fluidizar el soporte. Algunos diseños de reactores novedosos, así como presiones superiores a las normales, permitieron al 8800 alcanzar escalas que prepararían 1 mmol de oligonucleótido. A mediados de la década de 1990, varias empresas desarrollaron plataformas basadas en cromatógrafos líquidos preparativos y semipreparativos. Estos sistemas eran muy adecuados para un enfoque de reactor de columna. En la mayoría de los casos, todo lo que se necesitaba era aumentar la cantidad de fluidos que podían entregarse a la columna. La síntesis de oligonucleótidos requiere un mínimo de 10 y los cromatógrafos líquidos suelen tener capacidad para 4. Esta fue una tarea de diseño sencilla y algunas estrategias semiautomáticas funcionaron sin ninguna modificación en el equipo LC preexistente. PerSeptive Biosystems y Pharmacia (GE) fueron dos de varias empresas que desarrollaron sintetizadores a partir de cromatógrafos líquidos. Genomic Technologies, Inc. ^[104] fue una de las pocas empresas que desarrolló un sintetizador de oligonucleótidos a gran escala que era, desde cero, un sintetizador de oligonucleótidos. La plataforma inicial llamada VLSS para sintetizadores a muy gran escala utilizaba grandes columnas de cromatógrafo líquido de Pharmacia como reactores y podía sintetizar hasta 75 mmol de material. Muchas fábricas de síntesis de oligonucleótidos diseñaron y fabricaron sus propias plataformas personalizadas y se sabe poco debido a que los diseños son propietarios. El diseño VLSS continuó perfeccionándose y continúa en el sintetizador QMaster ^[105], que es una plataforma reducida que proporciona cantidades de miligramos a gramos de oligonucleótido sintético.

Recientemente se han revisado las prácticas actuales de síntesis de oligonucleótidos modificados químicamente a gran escala. ^[106]

Síntesis de microarrays de oligonucleótidos.

Se puede visualizar una micromatriz de oligonucleótidos como una placa multipocillos en miniatura donde se eliminan intencionalmente los divisores físicos entre los pocillos (paredes de plástico). Con respecto a la química, la síntesis de micromatrices de oligonucleótidos se diferencia de la síntesis de oligonucleótidos convencional en dos aspectos:

Fosforamidita de nucleósido protegida con 5'- O -MeNPOC.

• Los oligonucleótidos permanecen permanentemente unidos a la fase sólida, lo que requiere el uso de enlazadores que sean estables en las condiciones del procedimiento de desprotección final.
• La ausencia de divisores físicos entre los sitios ocupados por oligonucleótidos individuales, un espacio muy limitado en la superficie del microarray (una secuencia de oligonucleótidos ocupa un cuadrado de 25×25 μm) ^[107] y el requisito de alta fidelidad de la síntesis de oligonucleótidos dictan el uso de técnicas de desprotección 5' selectivas de sitio. En un enfoque, la eliminación del grupo 5'- O -DMT se efectúa mediante generación electroquímica del ácido en el(los) sitio(s) requerido(s). ^[108] Otro enfoque utiliza el grupo protector 5'- O- (α-metil-6-nitropiperoniloxicarbonilo) (MeNPOC), que puede eliminarse mediante irradiación con luz UV de longitud de onda de 365 nm. ^[107]

Procesamiento postsintético

Una vez completado el ensamblaje de la cadena, el oligonucleótido unido al soporte sólido está completamente protegido:

• El grupo 5'-hidroxi 5'-terminal está protegido con un grupo DMT;
• Los restos internucleosídicos de fosfato o fosforotioato están protegidos con grupos 2-cianoetilo;
• Los grupos amino exocíclicos en todas las bases nucleicas excepto T y U están protegidos con grupos protectores acilo.

Para proporcionar un oligonucleótido funcional, es necesario eliminar todos los grupos protectores. La protección de la base N-acilo y la protección del fosfato de 2-cianoetilo pueden eliminarse, y a menudo se eliminan simultáneamente, mediante tratamiento con bases inorgánicas o aminas. Sin embargo, la aplicabilidad de este método está limitada por el hecho de que la escisión de la protección del fosfato de 2-cianoetilo da lugar a acrilonitrilo como producto secundario. Bajo las fuertes condiciones básicas requeridas para la eliminación de la protección del N-acilo, el acrilonitrilo es capaz de alquilar bases nucleicas, principalmente, en la posición N3 de los residuos de timina y uracilo para dar los respectivos aductos de N3-(2-cianoetilo) a través de Michael. reacción . La formación de estos productos secundarios se puede evitar tratando los oligonucleótidos unidos al soporte sólido con soluciones de bases en un disolvente orgánico, por ejemplo, con 50% de trietilamina en acetonitrilo ^[109] o 10% de dietilamina en acetonitrilo. ^[110] Este tratamiento se recomienda encarecidamente para preparaciones a mediana y gran escala y es opcional para síntesis a pequeña escala donde la concentración de acrilonitrilo generado en la mezcla de desprotección es baja.

Independientemente de si los grupos protectores de fosfato se eliminaron primero, los oligonucleótidos unidos al soporte sólido se desprotegen usando uno de los dos enfoques generales.

• (1) Muy a menudo, el grupo 5'-DMT se elimina al final del conjunto de la cadena de oligonucleótidos. A continuación, los oligonucleótidos se liberan de la fase sólida y se desprotegen (base y fosfato) mediante tratamiento con hidróxido de amonio acuoso , metilamina acuosa , sus mezclas, ^[40] amoníaco o metilamina gaseosos ^[111] o, menos comúnmente, soluciones de otras aminas primarias o álcalis a temperatura ambiente o elevada. Esto elimina todos los grupos protectores restantes de los 2'-desoxioligonucleótidos, lo que da como resultado una mezcla de reacción que contiene el producto deseado. Si el oligonucleótido contiene residuos de ribonucleótidos protegidos en 2'- O , el protocolo de desprotección incluye el segundo paso en el que los grupos sililo protectores en 2'- O se eliminan mediante tratamiento con iones fluoruro mediante diversos métodos. ^[112] El producto completamente desprotegido se utiliza tal cual, o el oligonucleótido deseado se puede purificar mediante varios métodos. Más comúnmente, el producto crudo se desaliniza mediante precipitación con etanol , cromatografía de exclusión molecular o HPLC de fase inversa . Para eliminar productos de truncamiento no deseados, los oligonucleótidos se pueden purificar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o HPLC de intercambio aniónico seguido de desalación.
• (2) El segundo enfoque solo se utiliza cuando el método de purificación previsto es HPLC de fase inversa . En este caso, el grupo DMT 5'-terminal que sirve como mango hidrofóbico para la purificación se mantiene al final de la síntesis. El oligonucleótido se desprotege en condiciones básicas como se describe anteriormente y, tras la evaporación, se purifica mediante HPLC de fase inversa. A continuación, el material recogido se destritila en condiciones acuosas ácidas. A pequeña escala (menos de 0,01 a 0,02 mmol), a menudo se utiliza el tratamiento con ácido acético acuoso al 80% durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de la evaporación de la mezcla de reacción hasta sequedad al vacío . Finalmente, el producto se desala como se describe anteriormente.
• Para algunas aplicaciones, se pueden unir grupos indicadores adicionales a un oligonucleótido utilizando una variedad de procedimientos postsintéticos.

Caracterización

ES MS deconvolucionada del oligonucleótido crudo 5'-DMT-T ₂₀ (masa calculada 6324,26 Da).

Como ocurre con cualquier otro compuesto orgánico, es prudente caracterizar los oligonucleótidos sintéticos durante su preparación. En casos más complejos (investigación y síntesis a gran escala) los oligonucleótidos se caracterizan tras su desprotección y tras su purificación. Aunque el enfoque definitivo para la caracterización es la secuenciación , un procedimiento rutinario y relativamente económico, las consideraciones de reducción de costos excluyen su uso en la fabricación rutinaria de oligonucleótidos. En la práctica diaria, basta con obtener la masa molecular de un oligonucleótido registrando su espectro de masas . Actualmente se utilizan ampliamente dos métodos para la caracterización de oligonucleótidos: espectrometría de masas por electropulverización (ESI MS) y espectrometría de masas por tiempo de vuelo de ionización/desorción láser asistida por matriz ( MALDI-TOF ). Para obtener espectros informativos, es muy importante intercambiar todos los iones metálicos que puedan estar presentes en la muestra por iones de amonio o trialquilamonio [ ec trietilamonio, (C ₂ H ₅ ) ₃ NH ⁺ ] antes de enviar una muestra al análisis mediante de los métodos.

• En los espectros ESI MS, un oligonucleótido determinado genera un conjunto de iones que corresponden a diferentes estados de ionización del compuesto. Así, el oligonucleótido con masa molecular M genera iones con masas (M – n H)/ n donde M es la masa molecular del oligonucleótido en forma de ácido libre (todas las cargas negativas de los grupos fosfodiéster internucleosídicos se neutralizan con H ⁺ ) , n es el estado de ionización y H es la masa atómica del hidrógeno (1 Da ). Los más útiles para la caracterización son los iones con n entre 2 y 5. El software suministrado con los instrumentos fabricados más recientemente es capaz de realizar un procedimiento de deconvolución , es decir, encuentra picos de iones que pertenecen al mismo conjunto y deriva la masa molecular de el oligonucleótido.
• Para obtener información más detallada sobre el perfil de impurezas de los oligonucleótidos, se utiliza cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS o HPLC-MS) ^[113] o espectrometría de masas por electroforesis capilar (CEMS) ^{[114] .}

Ver también

• Ácidos nucleicos
• Análogos de ácidos nucleicos
• ácido nucleico peptídico
• Ácidos nucleicos puenteados

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