La secuenciación de parches (patch-seq) es una modificación de la técnica de patch-clamp que combina la caracterización electrofisiológica , transcriptómica y morfológica de neuronas individuales. En este enfoque, el citoplasma de la neurona se recolecta y procesa para RNAseq después de que se realizan registros electrofisiológicos en él. Simultáneamente, la célula se llena con un tinte que permite la posterior reconstrucción morfológica.
Si bien las propiedades eléctricas de una neurona son importantes a la hora de definir un tipo de célula, su morfología , los tipos de neurotransmisores liberados, los receptores de neurotransmisores expresados en las sinapsis, así como la ubicación de la neurona en el sistema nervioso y su circuito local son igualmente importantes. Las neuronas tienen una enorme diversidad de formas con muchas diferencias en los cuerpos celulares (soma) , las dendritas y los axones . La posición de las dendritas determina de qué otras neuronas recibe información una célula y su forma puede tener un impacto enorme en la forma en que las neuronas responden a esta información. Asimismo, los objetivos del axón de una neurona determinan sus salidas. Los tipos de sinapsis que se forman entre los axones y las dendritas de las neuronas también son igualmente importantes. [1] Por ejemplo, en el microcircuito cortical de la corteza de los mamíferos, representado a la derecha, las células tienen patrones de proyección altamente específicos tanto dentro del circuito local como a través de regiones corticales y no corticales. La geometría dendrítica también influye en el comportamiento eléctrico de las neuronas, teniendo una influencia enorme en cómo las dendritas procesan las entradas en forma de potenciales postsinápticos . Los trastornos de la geometría y los patrones de proyección se han relacionado con un conjunto diverso de afecciones psiquiátricas y neurológicas, incluidos el autismo y la esquizofrenia, aunque aún no se comprende la relevancia conductual de estos fenotipos. [2] Los tipos de células neuronales a menudo parecían variar continuamente entre sí. Los intentos anteriores de clasificación neuronal mediante propiedades morfoeléctricas se han visto limitados por el uso de metodologías incompatibles y una selección de líneas celulares diferentes. [3]
Con la llegada de la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq), se esperaba que existieran genes que se expresaran de manera consistente solo en neuronas con propiedades específicas definidas clásicamente. Estos genes servirían como marcadores celulares. Esto proporcionaría un mejor medio para delimitar tipos de neuronas de forma rápida y sencilla utilizando únicamente la secuenciación de ARNm. Sin embargo, pareció que scRNA-seq solo sirvió para reforzar el hecho de que las definiciones de tipos de células demasiado rígidas no siempre son la mejor manera de caracterizar las neuronas. [4] Además, la expresión génica está regulada dinámicamente, variando en varias escalas de tiempo en respuesta a la actividad en formas específicas del tipo celular para permitir la plasticidad neuronal. [5] [6] Al igual que otros tejidos, los procesos de desarrollo también deben considerarse. [7] Hacer coincidir los resultados de scRNA-seq con tipos de células neuronales definidos clásicamente es un gran desafío por todas estas razones [8] y, además, RNA-seq unicelular tiene sus propios inconvenientes para la clasificación neuronal. Si bien scRNA-seq permite el estudio de patrones de expresión genética de neuronas individuales, altera el tejido para el aislamiento de células individuales y, por lo tanto, es difícil inferir la posición original de una neurona en el tejido u observar su morfología. Vincular la información de secuenciación a un subtipo neuronal, definido previamente por características electrofisiológicas y morfológicas, es un proceso lento y complicado. [9] La captura e integración simultáneas de múltiples tipos de datos mediante patch-seq lo hace ideal para la clasificación neuronal, descubriendo nuevas correlaciones entre la expresión genética, las propiedades electrofisiológicas y morfológicas y la función neuronal. [10] Esto hace que patch-seq sea un método verdaderamente interdisciplinario, que requiere la colaboración entre especialistas en electrofisiología, secuenciación e imágenes. [10]
Patch-seq se puede realizar en cualquier sistema modelo, incluido el cultivo celular de neuronas. Las neuronas para cultivo pueden recolectarse del tejido neuronal y luego disociarse [11] o prepararse a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) , neuronas que se han cultivado a partir de líneas de células madre humanas. [12] La preparación de cultivo celular es la más fácil de aplicar y le da al experimentador control sobre a qué ligandos está expuesta la neurona, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores. Sin embargo, el beneficio del control experimental total también significa que las neuronas no están sujetas al entorno natural al que estarían expuestas durante el desarrollo. Como se mencionó anteriormente, la posición a la que se extienden sus dendritas y axones, así como la posición de la neurona en una estructura cerebral, es increíblemente importante para comprender su papel dentro de un circuito. Existen muchas preparaciones para cortes de cerebro de diferentes especies animales. [13] [14] Debido a la presencia de células o residuos en el camino de la pipeta y una celda objetivo, será necesario modificar ligeramente la preparación; a menudo se aplica una ligera presión positiva a la pipeta para evitar que se formen sellos no deseados. Si resulta interesante comprender cómo se relaciona el comportamiento con la dinámica de los eventos neuronales , también es posible realizar registros in vivo . Aunque adaptar el parche para estudios in vivo puede ser muy difícil por razones mecánicas, especialmente durante una tarea conductual, ya se ha hecho. [15] Se han desarrollado métodos automatizados de abrazadera de parche in vivo . [16] Existe muy poca diferencia entre las preparaciones para especies de mamíferos, aunque la mayor diversidad de tamaños neuronales en primates no humanos y en la corteza de primates puede requerir el uso de diferentes diámetros de punta y presiones para formar sellos sin matar las neuronas objetivo. [10] Patch-seq también se aplica a estudios no neuronales, como células pancreáticas o cardíacas. [17]
Después de elegir un sistema modelo y el tipo de preparación, los experimentos de secuencia de parches tienen un flujo de trabajo similar. Primero se establece un sello entre la celda y la pipeta para que se pueda realizar el registro y la recolección. Las celdas se pueden llenar con una etiqueta fluorescente para obtener imágenes durante la grabación. [18] Después del registro, se aplica presión negativa para capturar el citosol y, a menudo, el núcleo para la secuenciación. Este proceso se repite hasta que las células de la preparación se hayan degradado y no valga la pena recopilar datos de ellas. El análisis post hoc de los datos de imágenes permite la reconstrucción morfológica. Del mismo modo, a menudo también se requiere un procesamiento post-hoc complejo de datos transcriptómicos para manejar una gran cantidad de factores de confusión al recolectar contenidos citosólicos de las células a través de la pipeta. [19] [20] [21] En las etapas iniciales, antes de formar el sello entre la pipeta y la célula, las rodajas de tejido se preparan utilizando un vibratomo comprestome . Para obtener secciones delgadas de tejido, se utilizan estos dispositivos. Este dispositivo garantiza que las células diana sean accesibles para sujetar el parche. La calidad y precisión del corte de tejido son importantes para el éxito del experimento patch-seq. El grosor y el estado de estos cortes de tejido influyen en la eficacia de la focalización celular y en la calidad del sellado del parche. Una preparación de corte adecuada es esencial para el éxito general del flujo de trabajo de patch-seq. [22]
La pipeta de parche está diseñada para el registro de células completas, por lo que su diámetro de apertura es mayor que el de los experimentos realizados para examinar canales iónicos individuales. En su mayor parte, se pueden utilizar protocolos de abrazadera de parche estándar, aunque existen algunas pequeñas modificaciones que dependen de la situación en la pipeta y la solución interna. Se puede utilizar un diámetro aún más amplio para facilitar la aspiración del interior de la célula hacia la pipeta, pero es posible que sea necesario ajustarlo según el tipo de célula objetivo. [23] Se aplica presión negativa para mejorar el sellado, lo que será mejor para el registro y evitará la fuga de líquido intracelular y la contaminación después o durante la recolección del contenido celular para la secuenciación. Durante el registro, la biotina se puede difundir en la célula a través de la pipeta para obtener imágenes y posterior reconstrucción morfológica. [18]
Una vez que se ha establecido el sello, las células se someten a diferentes regímenes de estimulación utilizando la pinza de voltaje , como rampas, pulsos cuadrados e inyecciones de corriente ruidosas. Se registran las características de la membrana del cuerpo celular, incluido el potencial de membrana en reposo y el potencial umbral . También se registran las características observadas a partir de los potenciales de acción (AP) generados, como el ancho de AP, la amplitud de AP, la amplitud después de la despolarización y la amplitud después de la hiperpolarización. [3] [9] Los registros de células completas se realizan utilizando pipetas de recodificación de parches llenas con un pequeño volumen de solución intracelular (para evitar la dilución del ARN), quelantes de calcio, transportadores de ARN e inhibidores de la ARNasa. [10] La adición de inhibidores de la RNasa, como EGTA, mejora el análisis del transcriptoma al preservar el ARN de mayor calidad de las muestras. [9] El tiempo de grabación puede tardar entre 1 y 15 minutos sin afectar la estructura neuronal debido a la inflamación, y valores más bajos aumentan el rendimiento de la técnica. [14] Los datos se registran y analizan con software comercial o de código abierto como MIES, [3] [24] PATCHMASTER, [25] pCLAMP, [26] WaveSurfer, [27] entre otros.
Las neuronas se preestimulan para verificar su potencial de membrana en reposo y estabilizar su línea de base a través y dentro de los experimentos. A continuación, las células se estimulan mediante corrientes en rampa y cuadradas, y se registran y miden sus propiedades electrofisiológicas. Después del estímulo, el potencial de membrana debe volver al valor inicial para que los registros sean consistentes y sólidos. Se utiliza presión negativa al final de las grabaciones para devolver la estabilidad de la membrana. Las mediciones deben satisfacer estas condiciones para poder ser consideradas en análisis posteriores. [14] Durante el registro es necesario mantener la viabilidad celular, ya que el parcheo es estresante para la célula.
Es crucial tener cortes cerebrales vivos o agudos sanos para los registros electrofisiológicos, ya que la salud de la neurona afecta significativamente la calidad de los datos obtenidos. Los cortes de cerebro sanos generalmente se preparan utilizando herramientas como el vibratomo Compresstome, lo que garantiza condiciones óptimas para grabaciones precisas y confiables. [28]
Se utiliza presión negativa para mover el núcleo cerca de la punta de la pipeta mientras se mueve el electrodo cerca del centro del soma. El sistema modelo en cuestión afectará la presión negativa que se aplicará. En primates humanos y no humanos, la viabilidad celular es más difícil de garantizar. Mayores variaciones en el tamaño neuronal en comparación con los modelos de roedores significan una mayor variabilidad en la cantidad de presión negativa necesaria para extraer el citosol y el núcleo. [10] Después de la recuperación, la pipeta se retrae lentamente mientras se mantiene la presión negativa hasta que la membrana que rodea el núcleo se desprende de la célula y la punta forma un sello de membrana. El sello de membrana atrapa el contenido extraído en la pipeta y evita la contaminación durante la extracción para la secuenciación antes de preparar la pipeta para otra grabación. La construcción del sello se puede observar eléctricamente por el aumento de la resistencia (MΩ). [14] El proceso de recuperación es lento, a menudo toma alrededor de diez minutos, ya que se necesita precisión para no reventar la celda. [14]
El análisis de secuencia de ARN se realiza utilizando el núcleo y el citosol extraídos de las neuronas registradas. [9] [14] El ARN se amplifica hasta obtener ADNc de longitud completa y se construyen bibliotecas para la secuenciación. Los análisis que incluyen el núcleo no solo tienen mayores rendimientos de ARNm sino que también tienen una mayor calidad de los datos. [3]
Las muestras presentan un alto grado de variabilidad en el contenido de ARN, incluyendo en algunos casos contaminación por ARN de células adyacentes como astrocitos u otro tipo de neuronas. La calidad se evalúa mediante genes marcadores definidos, que indican si el contenido de ARN incluye objetivos de la clase de células de interés ( en el marcador) y carece de marcadores de contaminación ( fuera del marcador). [14] Se utilizan varias métricas para juzgar la calidad del ARN recolectado.
La forma y estructura de las neuronas, como la arborización dendrítica/axonal, la geometría axonal, los contactos sinápticos y la ubicación del soma, se utilizan para la clasificación del tipo neuronal. En preparaciones de cortes agudos o in vivo se observa la posición laminar ya que también tiene importantes consecuencias funcionales. La tinción con biotina se realiza durante el registro electrofisiológico de las neuronas. [30] Alternativamente , la rodamina agregada fuera de la célula permite imaginar la célula viva antes de la grabación. [31] Las imágenes se obtienen mediante imágenes en mosaico bidimensionales mediante transmisión de campo brillante y canales de fluorescencia en células individuales y luego se procesan en software comercial o de código abierto. [14] Se pueden obtener imágenes de mayor resolución a partir de neuronas cultivadas en comparación con cortes agudos, lo que produce reconstrucciones morfológicas de mayor calidad. [10]
La reconstrucción 3D post hoc se realiza mediante software de procesamiento de imágenes como TReMAP, [32] Mozak, [33] o Vaa3D. [34] La calidad del resultado depende de una variedad de factores, desde el tiempo de registro electrofisiológico hasta el procedimiento de extracción del núcleo. Luego, las células reconstruidas se clasifican en cuatro niveles de calidad según su integridad y la integridad de la estructura. Calidad alta si los somas y los procesos son completamente visibles y es posible una reconstrucción digital adecuada, calidad media si los somas y algunos procesos son visibles pero no son compatibles con la reconstrucción 3D, axón insuficiente donde las dendritas están llenas de biotina pero los axones están débilmente teñidos y rellenos fallidos que carecen de tinción de soma probablemente debido al hundimiento de la estructura después de la extracción nuclear. [14]
El diseño del flujo de trabajo para procesar y combinar los datos multimodales resultantes depende de la pregunta de investigación particular a la que se aplica patch-seq. En los estudios de tipificación celular, los datos deben compararse con los estudios de scRNA-seq existentes con tamaños de muestra más grandes (del orden de miles de células en comparación con decenas o cientos) y, por lo tanto, mayor poder estadístico para la identificación del tipo celular utilizando solo datos transcriptómicos. Los métodos basados en correlación son suficientes para este paso. [3] [35] Los métodos de reducción de dimensionalidad, como la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en T o la aproximación y proyección de colectores uniformes, se pueden utilizar para visualizar la posición de los datos recopilados en un atlas de referencia de datos de scRNA-seq de mayor calidad. [36] El aprendizaje automático se puede aplicar para relacionar los datos de expresión genética con los datos morfológicos y electrofisiológicos. Los métodos para hacerlo incluyen codificadores automáticos , [37] redes de cuello de botella , [38] u otros métodos de reducción de rango. [36] Incluir datos morfológicos ha demostrado ser un desafío ya que es una tarea de visión por computadora , un problema notoriamente complicado en el aprendizaje automático . Es difícil representar los datos de imágenes de las reconstrucciones morfológicas como un vector de características para incluirlos en el análisis. [10]
El conjunto de datos integradores de Patch-seq permite una caracterización completa de los tipos de células, particularmente en las neuronas. Los neurocientíficos han aplicado esta técnica a una variedad de experimentos y protocolos para descubrir nuevos subtipos de células basados en correlaciones entre datos transcriptómicos y propiedades morfoeléctricas neuronales. Al aplicar el aprendizaje automático a los datos de patch-seq, es posible estudiar datos transcriptómicos y vincularlos a sus respectivas propiedades morfoeléctricas. [10] Tener una verdad fundamental confirmada para una clasificación sólida de tipos de células permite a los investigadores observar la función de tipos y subtipos de neuronas específicos en procesos complejos como el comportamiento, el lenguaje y los procesos subyacentes en enfermedades neurológicas y psiquiátricas. La comparación de la proteómica con la transcriptómica ha demostrado que los datos transcripcionales no se traducen necesariamente en la misma expresión proteica [39] y, además, tener la capacidad de observar la verdad fundamental del fenotipo de una neurona a partir de métodos de clasificación clásicos combinados con datos transcriptómicos es importante para la neurociencia. Se han encontrado experimentos de patch-seq que respaldan los resultados transcriptómicos, pero otros han encontrado casos en los que la morfología de tipos de células similares definidos transcriptómicamente en diferentes regiones del cerebro no coincidía. [10] La técnica es particularmente adecuada para la neurociencia, pero en general cualquier tejido donde sea interesante conocer simultáneamente la electrofisiología, la morfología y la transcriptómica encontraría uso para patch-seq. Por ejemplo, patch-seq también se ha aplicado a tejidos no neuronales, como los islotes pancreáticos, para estudiar la diabetes. [17]
La limitación más grave de patch-seq es una limitación que comparten las técnicas de patch-clamp en general, siendo el requisito de alta fidelidad y trabajo manual diestro. La sujeción del parche se ha descrito como una forma de arte y requiere práctica para perfeccionar la técnica. Por lo tanto, no sólo requiere mucha mano de obra, sino que también requiere años de capacitación para perfeccionar la técnica. [42] [43] Hasta la fecha, el estudio de secuenciación de parches más grande se realizó en cortes corticales agudos de la corteza visual primaria de ratón . Se parchearon y secuenciaron poco más de 4.000 neuronas y el esfuerzo requirió una enorme cantidad de trabajo manual. [14] La mayoría de los demás conjuntos de datos se recopilaron de decenas o cientos de células. Significativamente menos que las células recolectadas para secuenciar disociando el tejido. [10] Sin embargo, ninguna otra técnica de registro electrofisiológico puede igualar la resolución temporal o la capacidad de patch-seq para caracterizar corrientes iónicas específicas ni ofrecer la capacidad de producir una abrazadera de voltaje. Por estas razones, la automatización de la técnica es un área de investigación activa por parte de muchos laboratorios de todo el mundo para aplicaciones que utilizan sujeción con parches, incluido patch-seq.
La reconstrucción morfológica mediante imágenes digitales es otra limitación de la técnica, con tasas de aprobación a menudo inferiores al 50%. [14] La integración adecuada de la enorme cantidad de imágenes con grandes cantidades de ruido y la alteración estructural causada por la extracción del núcleo lo convierte en un desafío computacional en neurociencia. Se están desarrollando nuevos métodos de rastreo automático, pero la calidad sigue siendo baja. [44]
Hasta ahora, la única tecnología de secuenciación utilizada ha sido la secuenciación de ARNm. Incluir también otras modalidades aumentaría el número de " ómicas " incluidas en los datos generados. Por ejemplo, una técnica para separar el ARNm del ADN podría permitir estudiar modificaciones en el ADN. [23] La accesibilidad a la cromatina podría juzgarse a partir de la metilación del ADN y el uso de inmunoprecipitación del ADN metilado y acetilación y desacetilación de histonas a partir de la secuenciación de ChIP . Esto permitiría el estudio de la epigenética en experimentos de secuencia de parches. Del mismo modo, separar las proteínas sería útil para juzgar la abundancia de proteínas, lo que permitiría la integración con la proteómica . CRISPR podría incluirse en la pipeta e inyectarse durante el registro para examinar los efectos de la mutación a nivel de una sola célula. [10]
El mayor obstáculo para el rendimiento de patch-seq es la mano de obra necesaria para sujetar el parche. La abrazadera de parche lentamente automatizada está comenzando a convertirse en la norma, pero hasta el momento no ha alcanzado una adopción amplia. Esto es a pesar de que algunas plataformas de ruta automática tienen una tasa de intentos de sellado y una tasa de recopilación de datos más altas que los humanos. La sujeción de parches automatizada se puede realizar a ciegas sin información de imágenes, en lugar de depender de sensores de presión para proporcionar información para los algoritmos que guían las plataformas robóticas para formar sellos y registrar. Alternativamente, también existen algoritmos guiados por imágenes que permiten apuntar a células marcadas con fluorescencia. Algunos sistemas se adaptan mejor a sistemas y preparaciones modelo particulares. [43] [1]