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Inmunoprecipitación por reticulación

La reticulación e inmunoprecipitación ( CLIP o CLIP-seq ) es un método utilizado en biología molecular que combina la reticulación UV con la inmunoprecipitación para identificar los sitios de unión del ARN de las proteínas a escala del transcriptoma, aumentando así nuestra comprensión de las redes reguladoras postranscripcionales. [1] [2] [3] La CLIP se puede utilizar con anticuerpos contra proteínas endógenas, o con etiquetas de péptidos comunes (incluidos FLAG, V5, HA y otros) o purificación por afinidad, lo que permite la posibilidad de perfilar organismos modelo o RBP que de otro modo carecerían de anticuerpos adecuados. [4]

Flujo de trabajo

Principio básico de CLIP

El método CLIP comienza con la reticulación in vivo de complejos de ARN-proteína mediante luz ultravioleta (UV). Tras la exposición a la luz ultravioleta, se forman enlaces covalentes entre proteínas y ácidos nucleicos que se encuentran muy próximos (a una distancia del orden de angstroms). [5] A continuación, se lisan las células reticuladas, se fragmenta el ARN y se aísla la proteína de interés mediante inmunoprecipitación. Para permitir la preparación de la transcripción inversa, se ligan adaptadores de ARN a los extremos 3' y se marcan los fragmentos de ARN para permitir el análisis de los complejos de ARN-proteína después de que se hayan separado del ARN libre mediante electroforesis en gel y transferencia de membrana. A continuación, se realiza la digestión con proteinasa K para eliminar la proteína del ARN reticulado, lo que deja unos pocos aminoácidos en el sitio de reticulación. Esto a menudo conduce al truncamiento de los ADNc en el nucleótido reticulado, lo que se aprovecha en variantes como iCLIP para aumentar la resolución del método. [6] Luego, el ADNc se sintetiza mediante RT-PCR seguida de una secuenciación de alto rendimiento seguida de un mapeo de las lecturas al transcriptoma y otros análisis computacionales para estudiar los sitios de interacción. [2]

Historia y aplicaciones

CLIP se realizó originalmente para estudiar las interacciones entre la proteína de unión al ARN específica de las neuronas y los factores de empalme NOVA1 y NOVA2 en el cerebro del ratón , identificando los sitios de unión del ARN que contenían los motivos de unión a Nova esperados. La secuenciación de la biblioteca de ADNc identificó muchas posiciones cercanas a exones alternativos, varios de los cuales se encontró que requerían Nova1/2 para sus patrones de empalme específicos del cerebro. [1] En 2008, CLIP se combinó con la secuenciación de alto rendimiento (denominada "HITS-CLIP") para generar mapas de interacción proteína-ARN de todo el genoma para Nova; [7] Desde entonces, se han estudiado otras proteínas de unión al ARN con CLIP, incluyendo PTBP1, [8] RbFox2 (donde se lo denominaba "CLIP-seq"), [9] SFRS1, [10] Argonaute, [11] [ 12] [13] hnRNP C, [6] la proteína de retraso mental del cromosoma X frágil FMRP, [14] [15] Ptbp2 (en el cerebro del ratón), [16] Mbnl2, [17] las proteínas nElavl (las proteínas Hu específicas de las neuronas), [18] y se ha aplicado a las proteínas de unión al ARN de todos los reinos de la vida, incluidos los procariotas. [19] El análisis CLIP de la proteína de unión al ARN Argonaute condujo a la identificación de objetivos de microARN [20] mediante la decodificación de mapas de interacción microARN -ARNm y proteína-ARN en el cerebro del ratón [11] [21] y posteriormente en levadura en ciernes ( Saccharomyces cerevisiae ) , [22] Caenorhabditis elegans , [23] células madre embrionarias [24] y células de cultivo de tejidos. [25]

Métodos

CLIPS DE ÉXITOS

CLIPS DE ÉXITOS [26] [27]

HITS-CLIP combina la reticulación UV y la inmunoprecipitación con la secuenciación de alto rendimiento para identificar los sitios de unión de las proteínas de unión al ARN. [5] HITS-CLIP también introdujo la adición de códigos de barras de dinucleótidos a los cebadores, lo que proporciona la capacidad de secuenciar y luego deconvolucionar múltiples experimentos simultáneamente. [7] Con el análisis de los sitios de mutación inducida por reticulación (CIMS) a altas profundidades de secuenciación , los sitios de reticulación se pueden diferenciar de otras fuentes de variación de secuencia. [28]

CLIP DE PAR

CLIP DE PAR [26] [27]

El método PAR-CLIP (entrecruzamiento e inmunoprecipitación mejorados con ribonucleósidos fotoactivables) también se utiliza para identificar los sitios de unión de las proteínas de unión al ARN celular (RBP) y los complejos de ribonucleoproteína que contienen microARN (miRNP). [25] El método se basa en la incorporación de análogos de ribonucleósidos fotorreactivos, como la 4-tiouridina (4-SU) y la 6-tioguanosina (6-SG) en las transcripciones de ARN nacientes por parte de células vivas. La irradiación de las células con luz ultravioleta de 365 nm induce un entrecruzamiento eficiente de los ARN celulares marcados con nucleósidos fotorreactivos con las RBP que interactúan. La inmunoprecipitación de la RBP de interés es seguida por el aislamiento del ARN entrecruzado y co-inmunoprecipitado. El ARN aislado se convierte en una biblioteca de ADNc y se secuencia en profundidad utilizando tecnología de secuenciación de alto rendimiento . La reticulación de los análogos 4-SU y 6-SG da como resultado transiciones de timidina a citidina y de guanosina a adenosina respectivamente. Como resultado, PAR-CLIP puede identificar las ubicaciones de los sitios de unión con gran precisión.

Sin embargo, la PAR-CLIP se limita principalmente a las células cultivadas, y la citotoxicidad de los nucleósidos es una preocupación; [2] se ha informado que la 4-SU inhibe la síntesis de ARN ribosómico, induce una respuesta de estrés nucleolar y reduce la proliferación celular. [29] La PAR-CLIP se ha empleado para determinar los sitios de unión de todo el transcriptoma de varias RBP conocidas y complejos de ribonucleoproteína que contienen microARN con alta resolución. Esto incluye las proteínas AGO y TNRC6 dirigidas a miARN. [21]

iCLIP

Clip [26] [27]

iCLIP (reticulación cruzada con resolución de nucleótidos individuales e inmunoprecipitación) es una variante de CLIP que permite la amplificación de ADNc truncados, que se producen cuando la transcripción inversa se detiene prematuramente en el sitio de reticulación. [6] Otros enfoques para identificar sitios de reticulación proteína-ARN incluyen el análisis mutacional de ADNc de lectura directa, como las transiciones de nucleótidos en PAR-CLIP , [25] o errores raros introducidos por la transcriptasa inversa cuando lee a través de los sitios de reticulación en los métodos HITS-CLIP estándar , denominados análisis de sitios de mutación inducida por reticulación (CIMS). [30]

iCLIP también agregó una secuencia aleatoria (identificador molecular único, UMI ) junto con códigos de barras experimentales al cebador utilizado para la transcripción inversa, codificando así los ADNc únicos para minimizar cualquier error o sesgo cuantitativo de la PCR y mejorando así la cuantificación de los eventos de unión. Permitir la amplificación de ADNc truncados condujo a la identificación de los sitios de interacciones ARN-proteína con alta resolución mediante el análisis de la posición de inicio de los ADNc truncados, así como su cuantificación precisa utilizando UMI con un software llamado "iCount". Estas innovaciones de iCLIP fueron adoptadas por variantes posteriores de CLIP como eCLIP e irCLIP. [4] Otra modificación de iCLIP, miCLIP, identifica sitios de ARN metilado con el uso de enzima mutante o anticuerpo específico de modificación. [31] [32] [2] La naturaleza cuantitativa de iCLIP permitió la comparación entre muestras a nivel de ARN completos, [33] o estudiar la unión competitiva de múltiples proteínas de unión a ARN [34] o cambios sutiles en la unión de una proteína mutante a nivel de picos de unión. [35]

Clip electrónico

eCLIP (Enhanced CrossLinking and ImmunoPrecipitation following by high-throughput sequencing) también se utiliza para mapear los sitios de unión de RBP en el transcriptoma de ARN. [36] eCLIP fue diseñado para mejorar iCLIP al aumentar la eficiencia en la conversión de fragmentos de ARN purificados en una biblioteca de ADNc. En su publicación, se informó que eCLIP aumentó dicha eficiencia en >1000 veces, lo que no solo disminuye la secuenciación desperdiciada de moléculas duplicadas de PCR, sino que también reduce drásticamente los fallos experimentales durante el procedimiento CLIP. Además, la amplificación en eCLIP ahora es comparable a RNA-seq, lo que permite una normalización cuantitativa rigurosa contra controles de entrada pareados (para eliminar el fondo en ARN ribosómico y otros ARN altamente abundantes), así como una comparación cuantitativa entre picos y muestras, lo que permite la capacidad de detectar la unión específica de alelos o la unión diferencial de ARN entre condiciones.
Al igual que en otros métodos CLIP, eCLIP se basa en interacciones RBP-ARN unidas covalentemente mediante reticulación UV de células vivas. Las células se lisan y el ARN se fragmenta utilizando un tratamiento limitado con ARNasa. Luego, se inmunoprecipita un RBP específico (y su ARN unido) utilizando un anticuerpo que reconoce específicamente el RBP objetivo. Después de la ligadura de un adaptador de ARN 3', el material inmunoprecipitado (así como una muestra de entrada emparejada) se procesan en geles de proteína desnaturalizante y se transfieren a membranas de nitrocelulosa. Se corta una región desde el tamaño de la proteína hasta 75 kDa anterior de la membrana y se trata con proteinasa K para liberar el ARN. Después de la limpieza, el ARN se transcribe de manera inversa a ssDNA, cuando se liga un segundo adaptador. Al ligar el segundo adaptador a los ADNc, eCLIP puede identificar ADNc truncados, de manera similar a iCLIP, y, de ese modo, estudiar los sitios de interacción proteína-ARN con alta resolución. Luego, se utiliza la amplificación por PCR para obtener material suficiente para la secuenciación de alto rendimiento. eCLIP también se puede utilizar para identificar dianas de miRNA y perfilar modificaciones de ARN como m6A.
Se han producido conjuntos de datos eCLIP para más de 150 RBP con anticuerpos validados disponibles comercialmente. [37]

Otros métodos CLIP

sCLIP (simple CLIP) es una técnica que requiere menores cantidades de ARN de entrada y omite el radiomarcado del ARN inmunoprecipitado. El método se basa en la amplificación lineal del ARN inmunoprecipitado y, por lo tanto, mejora la complejidad de la biblioteca de secuenciación a pesar de reducir significativamente la cantidad de material de entrada y omitir varios pasos de purificación. Además, permite una visualización sin radiomarcado del ARN inmunoprecipitado mediante el uso de una técnica de etiquetado basada en biotina de alta sensibilidad. Junto con una plataforma bioinformática, este método está diseñado para proporcionar conocimientos profundos sobre los interactomas ARN-proteína en la ciencia biomédica, donde la cantidad de material de partida suele ser limitada (es decir, en el caso de muestras clínicas valiosas). [38] También se han desarrollado variantes adicionales de iCLIP que conservan la resolución de nucleótidos individuales pero difieren en uno o más pasos del método iCLIP original. Estas incluyen iCLIP2, irCLIP, iiCLIP e iCLIP1.5, por nombrar algunas.

Como modificación de CLIP, se identificaron sitios de ARN metilados con el uso de una enzima mutante o un anticuerpo específico de modificación con los métodos denominados miCLIP o m6A-CLIP. [31] [32] [39] [2]

Ventajas y limitaciones

Ventajas

Las proteínas de unión al ARN son frecuentemente componentes de complejos multiproteicos, y los ARN de varios genes están presentes en las células en un rango de abundancia, por lo tanto, es común que los ARN unidos a proteínas copurificadas o que se adhieren de manera no específica a las perlas puedan aislarse cuando se inmunoprecipita una proteína específica. Se ha demostrado que la especificidad de los datos obtenidos utilizando métodos de inmunoprecipitación temprana como RIP depende de las condiciones de reacción del experimento, como las concentraciones de proteínas y las condiciones iónicas, y la reasociación de las proteínas de unión al ARN después de la lisis celular podría conducir a la detección de interacciones artificiales. [40] Se han utilizado métodos de reticulación con formaldehído para preservar las interacciones proteína-ARN, pero estos también generan enlaces cruzados proteína-proteína. Al emplear la reticulación UV que es específica para los contactos directos proteína-ARN, CLIP evita los enlaces cruzados proteína-proteína y garantiza una alta especificidad, al mismo tiempo que obtiene información posicional en los sitios de interacciones proteína-ARN.

Dado que la reticulación por UV crea un enlace covalente, los fragmentos de ARN reticulados retienen un péptido corto después de la digestión con proteinasa K, que se puede aprovechar para identificar el sitio de reticulación. La transcripción inversa suele truncarse en los sitios de reticulación, lo que crea ADNc truncados que son explotados por iCLIP, mientras que los ADNc de lectura continua a menudo contienen mutaciones en el sitio de reticulación (consulte HITS-CLIP y PAR-CLIP). [2]

Limitaciones

Resumen del CLIP [26] [28] [27]

Todos los protocolos de generación de bibliotecas CLIP requieren cantidades moderadas de células o tejido (50–100 mg), requieren numerosos pasos enzimáticos y análisis computacionales personalizados. [12] [41] Ciertos pasos son difíciles de optimizar y con frecuencia tienen baja eficiencia. Por ejemplo, la sobredigestión con ARNasa puede disminuir la cantidad de sitios de unión identificados y, por lo tanto, debe optimizarse. [27] La ​​eficiencia de reticulación también varía entre proteínas, [42] y se ha informado un sesgo de nucleótidos de reticulación, [43] por ejemplo al comparar sitios de reticulación y motivos enriquecidos cuando se estudian complejos proteína-ARN in vivo en células vivas e in vitro , [44] aunque se están desarrollando métodos para minimizar dicho sesgo para el descubrimiento de motivos enriquecidos. [45] Los objetivos de miRNA predichos computacionalmente derivados de TargetScan son comparables a CLIP en la identificación de objetivos de miRNA, lo que plantea preguntas sobre su utilidad en relación con las predicciones existentes. [46] Debido a que los métodos CLIP se basan en la inmunoprecipitación, el ARN reticulado podría afectar en algunos casos las interacciones anticuerpo-epítopo. Finalmente, se han observado diferencias significativas. Por lo tanto, los resultados CLIP sin procesar requieren análisis computacionales adicionales para investigar en profundidad las interacciones del sitio de unión proteína-ARN dentro de la célula.

Métodos similares

Lectura adicional

Referencias

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Fuentes