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iCLIP

iCLIP [1] [2] [3] (reticulación e inmunoprecipitación con resolución de nucleótidos individuales) es una variante del método CLIP original utilizado para identificar interacciones proteína-ARN, [4] que utiliza luz ultravioleta para unir covalentemente proteínas y moléculas de ARN para identificar los sitios de unión de las proteínas al ARN. Este paso de reticulación tiene generalmente menos fondo que los protocolos estándar de inmunoprecipitación de ARN (RIP), porque el enlace covalente formado por la luz ultravioleta permite fragmentar el ARN, seguido de una purificación rigurosa, y esto también permite que CLIP identifique las posiciones de las interacciones proteína-ARN. [5] Al igual que con todos los métodos CLIP , iCLIP permite una purificación muy rigurosa de los complejos proteína-ARN enlazados mediante un lavado riguroso durante la inmunoprecipitación seguido de SDS-PAGE y transferencia a nitrocelulosa. Los complejos proteína-ARN marcados se visualizan luego para el control de calidad, se escinden de la nitrocelulosa y se tratan con proteinasa para liberar el ARN, dejando solo unos pocos aminoácidos en el sitio de reticulación del ARN. [6]

El ARN se transcribe luego de forma inversa, lo que hace que la mayoría de los ADNc se trunquen en el sitio de enlace cruzado, y la innovación clave y la característica única en el desarrollo de iCLIP fue permitir que dichos ADNc truncados se amplifiquen por PCR y se secuencien utilizando una plataforma de secuenciación de próxima generación. iCLIP también agregó una secuencia aleatoria (identificador molecular único, UMI ) junto con códigos de barras experimentales al cebador utilizado para la transcripción inversa, codificando así los ADNc únicos para minimizar cualquier error o sesgo cuantitativo de la PCR y mejorando así la cuantificación de los eventos de unión. Permitir la amplificación de los ADNc truncados condujo a la identificación de los sitios de interacciones proteína-ARN a alta resolución mediante el análisis de la posición de inicio de los ADNc truncados, así como su cuantificación precisa utilizando UMI con un software llamado "iCount". [1] Todas estas innovaciones de iCLIP fueron adoptadas por variantes posteriores de CLIP [6] como eCLIP [7] e irCLIP. [8] Un enfoque adicional para identificar sitios de enlace cruzado proteína-ARN es el análisis mutacional de ADNc de lectura directa, como transiciones de nucleótidos en PAR-CLIP , [9] u otros tipos de errores que pueden ser introducidos por la transcriptasa inversa cuando lee a través del sitio de enlace cruzado en el método HITS-CLIP estándar con el análisis del sitio de mutación inducida por enlace cruzado (CIMS). [10]

La naturaleza cuantitativa de iCLIP permitió una comparación pionera entre muestras a nivel de ARN completos [11], o para estudiar la unión competitiva de múltiples proteínas de unión a ARN [12] o cambios sutiles en la unión de una proteína mutante a nivel de picos de unión. [13] Recientemente se desarrolló una variante mejorada de iCLIP (iiCLIP) para mejorar la eficiencia y conveniencia de la preparación de la biblioteca de ADNc, por ejemplo, eliminando enzimáticamente el adaptador después de la ligadura para minimizar los artefactos causados ​​por el arrastre del adaptador, introduciendo la visualización no radiactiva del complejo proteína-ARN (como se hizo originalmente con irCLIP [8] ), aumentando la eficiencia de las reacciones de ligadura, proteinasa y transcripción inversa, y permitiendo la purificación basada en perlas de ADNc. [14]

El análisis de los datos de secuenciación CLIP se beneficia del uso de software computacional personalizado, gran parte del cual está disponible como parte del pipeline Nextflow para el análisis CLIP, y hay software especializado disponible para la demultiplexación rápida de bibliotecas multiplexadas complejas, [15] visualización comparativa de perfiles de reticulación en ARN, [16] identificación de los picos de sitios de reticulación proteína-ARN agrupados e identificación de motivos de secuencia enriquecidos alrededor de reticulaciones prominentes. [17] Además, iMaps proporciona una plataforma web gratuita de análisis CLIP y una base de datos comunitaria bien curada para facilitar los estudios de redes reguladoras de ARN en organismos, con un backend basado en el pipeline Nextflow. Es aplicable a los muchos protocolos variantes de CLIP (como iCLIP, eCLIP, etc.) y se puede utilizar para analizar datos no publicados de manera segura, o para obtener datos CLIP públicos en un formato bien anotado, junto con varias formas de control de calidad, visualización y comparación. Las preguntas sobre los desafíos experimentales y computacionales se recopilan en el foro de preguntas y respuestas CLIP.

Referencias

  1. ^ ab König, Julian; Zarnack, Kathi; Rot, Gregor; Curk, Tomaz; Kayikci, Melis; Zupan, Blaz; Turner, Daniel J.; Luscombe, Nicholas M.; Ule, Jernej (julio de 2010). "iCLIP revela la función de las partículas hnRNP en el empalme con resolución de nucleótidos individuales". Nature Structural & Molecular Biology . 17 (7): 909–915. doi :10.1038/nsmb.1838. ISSN  1545-9985. PMC  3000544 . PMID  20601959.
  2. ^ Haberman, Nejc; Huppertz, Ina; Attig, Jan; König, Julian; Wang, Zhen; Hauer, Christian; Hentze, Matthias W.; Kulozik, Andreas E.; Le Hir, Hervé; Curk, Tomaž; Sibley, Christopher R.; Zarnack, Kathi; Ule, Jernej (16 de enero de 2017). "Información sobre el diseño e interpretación de experimentos iCLIP". Genome Biology . 18 (1): 7. doi : 10.1186/s13059-016-1130-x . ISSN  1474-760X. PMC 5240381 . PMID  28093074. 
  3. ^ König, Julian; Zarnack, Kathi; Luscombe, Nicholas M.; Ule, Jernej (18 de enero de 2012). "Interacciones proteína-ARN: nuevas tecnologías genómicas y perspectivas". Nature Reviews Genetics . 13 (2): 77–83. doi :10.1038/nrg3141. PMC 4962561 . PMID  22251872. 
  4. ^ Ule, Jernej; Jensen, Kirk B.; Ruggiu, Matteo; Mele, Aldo; Ule, Aljaz; Darnell, Robert B. (14 de noviembre de 2003). "CLIP identifica redes de ARN reguladas por Nova en el cerebro". Science . 302 (5648): 1212–1215. Bibcode :2003Sci...302.1212U. doi :10.1126/science.1090095. ISSN  1095-9203. PMID  14615540. S2CID  23420615.
  5. ^ Hafner, Markus; Katsantoni, Maria; Köster, Tino; Marks, James; Mukherjee, Joyita; Staiger, Dorothee; Ule, Jernej; Zavolan, Mihaela (4 de marzo de 2021). "CLIP y métodos complementarios". Nature Reviews Methods Primers . 1 (1): 1–23. doi : 10.1038/s43586-021-00018-1 . ISSN  2662-8449. S2CID  233834798.
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  8. ^ ab Zarnegar, Brian J.; Flynn, Ryan A.; Shen, Ying; Do, Brian T.; Chang, Howard Y.; Khavari, Paul A. (junio de 2016). "Plataforma irCLIP para la caracterización eficiente de interacciones proteína-ARN". Nature Methods . 13 (6): 489–492. doi :10.1038/nmeth.3840. ISSN  1548-7105. PMC 5477425 . PMID  27111506. 
  9. ^ Hafner, Markus; Landthaler, Markus; Burger, Lukas; Khorshid, Mohsen; Hausser, Jean; Berninger, Philipp; Rothballer, Andrea; Ascano, Manuel; Jungkamp, ​​Anna-Carina; Munschauer, Mathias; Ulrich, Alexander; Wardle, Greg S.; Dewell, Scott; Zavolan, Mihaela; Tuschl, Thomas (2010-04-02). "Identificación de sitios diana de microARN y proteína de unión a ARN en todo el transcriptoma mediante PAR-CLIP". Cell . 141 (1): 129–141. doi :10.1016/j.cell.2010.03.009. ISSN  1097-4172. PMC 2861495 . PMID  20371350. 
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  11. ^ Tollervey, James R.; Curk, Tomaž; Rogelj, Boris; Briese, Michael; Cereda, Mateo; Kayikci, Melis; König, Julián; Hortobágyi, Tibor; Nishimura, Agnes L.; Zupunski, Vera; Patani, Rickie; Chandran, Siddharthan; Podrido, Gregor; Zupan, Blaž; Shaw, Christopher E. (abril de 2011). "Caracterización de los objetivos de ARN y regulación de empalme dependiente de la posición por TDP-43". Neurociencia de la Naturaleza . 14 (4): 452–458. doi :10.1038/nn.2778. ISSN  1546-1726. PMC 3108889 . PMID  21358640. 
  12. ^ Zarnack, Kathi; König, Julian; Tajnik, Mojca; Martincorena, Iñigo; Eustermann, Sebastian; Stévant, Isabelle; Reyes, Alejandro; Anders, Simon; Luscombe, Nicholas M.; Ule, Jernej (31 de enero de 2013). "La competencia directa entre hnRNP C y U2AF65 protege al transcriptoma de la exonización de elementos Alu". Cell . 152 (3): 453–466. doi :10.1016/j.cell.2012.12.023. ISSN  1097-4172. PMC 3629564 . PMID  23374342. 
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  14. ^ Lee, Flora CY; Chakrabarti, Anob M.; Hanel, Heike; Monzón-Casanova, Elisa; Hallegger, Martina; Militti, Cristina; Capraro, Federica; Sadée, Christoph; Toolan-Kerr, Patrick; Wilkins, Óscar; Turner, Martín; König, Julián; Sibley, Christopher R.; Ule, Jernej (27 de agosto de 2021). "Un protocolo iCLIP mejorado": 2021.08.27.457890. bioRxiv 10.1101/2021.08.27.457890 . doi :10.1101/2021.08.27.457890. S2CID  237356396.  {{cite journal}}: Requiere citar revista |journal=( ayuda )
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