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La fluorescencia se utiliza en las ciencias de la vida generalmente como una forma no destructiva de rastrear o analizar moléculas biológicas. Algunas proteínas o moléculas pequeñas en las células son naturalmente fluorescentes, lo que se llama fluorescencia intrínseca o autofluorescencia (como NADH , triptófano o clorofila endógena , ficoeritrina o proteína fluorescente verde ). La fluorescencia intrínseca del ADN es muy débil [1] . Alternativamente, las proteínas específicas o generales, los ácidos nucleicos , los lípidos o las moléculas pequeñas se pueden "marcar" con un fluoróforo extrínseco, un tinte fluorescente que puede ser una molécula pequeña, una proteína o un punto cuántico . Existen varias técnicas para explotar propiedades adicionales de los fluoróforos , como la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia , donde la energía se transmite de forma no radiactiva a un tinte vecino particular, lo que permite detectar la proximidad o la activación de proteínas; otra es el cambio en las propiedades, como la intensidad, de ciertos tintes dependiendo de su entorno, lo que permite su uso en estudios estructurales. [2] [3] [4]
El principio detrás de la fluorescencia es que la fracción fluorescente contiene electrones que pueden absorber un fotón y entrar brevemente en un estado excitado antes de dispersar la energía de forma no radiactiva o emitirla como un fotón , pero con una energía menor, es decir, a una longitud de onda más larga (la longitud de onda y la energía son inversamente proporcionales). [5] La diferencia en las longitudes de onda de excitación y emisión se llama desplazamiento de Stokes , y el tiempo que tarda un electrón excitado en emitir el fotón se llama vida útil . El rendimiento cuántico es un indicador de la eficiencia del tinte (es la relación de fotones emitidos por fotón absorbido), y el coeficiente de extinción es la cantidad de luz que puede ser absorbida por un fluoróforo. Tanto el rendimiento cuántico como el coeficiente de extinción son específicos para cada fluoróforo y multiplicados juntos calculan el brillo de la molécula fluorescente. [6]
Los fluoróforos se pueden unir a las proteínas a través de grupos funcionales específicos, como:
o de forma no específica ( glutaraldehído ) o de forma no covalente ( por ejemplo, mediante hidrofobicidad , etc.).
Estos fluoróforos son moléculas pequeñas, proteínas o puntos cuánticos.
Los fluoróforos orgánicos fluorescen gracias a electrones deslocalizados que pueden saltar una banda y estabilizar la energía absorbida, por lo tanto, la mayoría de los fluoróforos son sistemas conjugados . Existen varias familias y sus excitaciones van desde el infrarrojo hasta el ultravioleta .
Los lantánidos (quelados) son metales fluorescentes únicos, que emiten gracias a transiciones que involucran órbitas 4 f , que están prohibidas, por lo tanto, tienen coeficientes de absorción muy bajos y emisiones lentas, requiriendo excitación a través de quelantes orgánicos fluorescentes ( por ejemplo, quelantes de terbio (III) basados en dipicolinato [7] ). Una tercera clase de fluoróforo de molécula pequeña es la de los complejos de metal de transición -ligando , que muestran fluorescencia molecular desde un estado de transferencia de carga de metal a ligando que está parcialmente prohibido, estos son generalmente complejos de rutenio , renio u osmio .
Los puntos cuánticos son nanopartículas semiconductoras fluorescentes que suelen ser más brillantes que los colorantes convencionales. Suelen ser más caros, tóxicos, no atraviesan las membranas celulares y no pueden ser fabricados por la célula.
Existen varias proteínas fluorescentes en la naturaleza [ cita requerida ] , pero la más importante como herramienta de investigación es la proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa Aequorea victoria , [8] que fluoresce espontáneamente al plegarse a través de residuos específicos de serina-tirosina-glicina. El beneficio que tienen la GFP y otras proteínas fluorescentes sobre los tintes orgánicos o los puntos cuánticos es que se pueden expresar de forma exógena en células solas o como una proteína de fusión , una proteína que se crea ligando el gen fluorescente (p. ej., GFP) a otro gen y cuya expresión está impulsada por un promotor de gen de mantenimiento u otro promotor específico. Este enfoque permite que las proteínas fluorescentes se utilicen como reporteros para cualquier número de eventos biológicos, como la localización subcelular y los patrones de expresión . Una variante de la GFP se encuentra naturalmente en los corales , específicamente en los Anthozoa , y se han creado varios mutantes para abarcar los espectros visibles y fluorescer durante más tiempo y de forma más estable. Otras proteínas son fluorescentes pero requieren un cofactor fluoróforo y, por lo tanto, solo se pueden utilizar in vitro ; Estos se encuentran a menudo en plantas y algas (fitofluores, ficobiliproteínas como la aloficocianina ).
Las técnicas anteriores se pueden combinar con métodos computacionales para estimar los niveles de tinción sin teñir la célula. Estos enfoques, por lo general, se basan en el entrenamiento de una red neuronal convolucional profunda para realizar un remapeo de imágenes, convirtiendo la imagen de campo claro o de fase en una imagen fluorescente. [9] [10] Al disociar el corpus de entrenamiento de las células bajo investigación, estos enfoques brindan una vía para usar tinciones que de otra manera serían incompatibles con la obtención de imágenes de células vivas, como la tinción de anticuerpos. [11]
La fluorescencia , la quimioluminiscencia y la fosforescencia son tres tipos diferentes de propiedades de luminiscencia , es decir, la emisión de luz de una sustancia. La fluorescencia es una propiedad en la que la luz se absorbe y se emite en unos pocos nanosegundos (aproximadamente 10 ns) a una energía más baja (=longitud de onda más alta), mientras que la bioluminiscencia es la quimioluminiscencia biológica , una propiedad en la que la luz se genera mediante una reacción química de una enzima sobre un sustrato. La fosforescencia es una propiedad de los materiales de absorber luz y emitir la energía varios milisegundos o más después (debido a transiciones prohibidas al estado fundamental de un estado triplete , mientras que la fluorescencia ocurre en estados singlete excitados ). Hasta hace poco, esto no era aplicable a la investigación en ciencias de la vida debido al tamaño de las partículas inorgánicas. Sin embargo, el límite entre la fluorescencia y la fosforescencia no está bien definido, ya que los complejos de metal de transición -ligando, que combinan un metal y varias fracciones orgánicas, tienen vidas medias largas, de hasta varios microsegundos (ya que muestran estados singlete-triplete mixtos).
Antes de su uso generalizado en las últimas tres décadas, la radiactividad era la etiqueta más común.
Las ventajas de la fluorescencia sobre los marcadores radiactivos son las siguientes:
Nota: un canal es similar a "color" pero distinto, es el par de filtros de excitación y emisión específicos para un colorante, por ejemplo, los microarrays de Agilent son de doble canal y funcionan con cy3 y cy5; estos se conocen coloquialmente como verde y rojo.
La fluorescencia no es necesariamente más conveniente de usar porque requiere un equipo de detección especializado propio. Para aplicaciones de cuantificación no cuantitativa o relativa puede ser útil, pero no es adecuada para realizar mediciones absolutas debido a la extinción de la fluorescencia , mientras que la medición de moléculas marcadas radiactivamente es siempre directa y altamente sensible.
Las desventajas de los fluoróforos incluyen:
La propiedad básica de la fluorescencia se utiliza ampliamente, como marcador de componentes marcados en células ( microscopía de fluorescencia ) o como indicador en solución ( espectroscopia de fluorescencia ), pero otras propiedades adicionales, que no se encuentran en la radiactividad, hacen que su uso sea aún más extenso.
La transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET, por sus siglas en inglés) es una propiedad en la que la energía del electrón excitado de un fluoróforo, llamado donante, se transmite a un colorante aceptor cercano, ya sea un extintor oscuro u otro fluoróforo, que tiene un espectro de excitación que se superpone con el espectro de emisión del colorante donante, lo que da como resultado una fluorescencia reducida. Esto se puede utilizar para:
Los colorantes sensibles al medio ambiente cambian sus propiedades (intensidad, vida media y espectros de excitación y emisión) dependiendo de la polaridad (hidrofobicidad y carga) de sus entornos. Algunos ejemplos incluyen: indol , amarillo cascada, prodan, dansilo, dapoxil, NBD, PyMPO, pireno y dietilaminocumarina.
Este cambio es más pronunciado cuando los grupos donadores y atractores de electrones se colocan en extremos opuestos de un sistema de anillo aromático, [13] ya que esto da como resultado un gran cambio en el momento dipolar cuando se excita.
Cuando un fluoróforo se excita, generalmente tiene un momento dipolar mayor (μ E ) que en el estado fundamental (μ G ). La absorción de un fotón por un fluoróforo tarda unos pocos picosegundos. Antes de que se libere esta energía (emisión: 1–10 ns), las moléculas de disolvente que rodean al fluoróforo se reorientan (10–100 ps) debido al cambio de polaridad en el estado singlete excitado; este proceso se denomina relajación del disolvente. Como resultado de esta relajación, la energía del estado excitado del fluoróforo se reduce (longitud de onda más larga), por lo tanto, los fluoróforos que tienen un gran cambio en el momento dipolar tienen cambios de desplazamiento de Stokes más grandes en diferentes disolventes. La diferencia entre los niveles de energía se puede determinar aproximadamente con la ecuación de Lipper-Mataga.
Un colorante hidrófobo
es un colorante que es insoluble en agua, una propiedad independiente del solvatocromismo. Además, el término sensible al medio ambiente en química en realidad describe cambios debidos a uno de una variedad de factores ambientales diferentes, como el pH o la temperatura, no solo la polaridad; sin embargo, en bioquímica, el fluoróforo sensible al medio ambiente y el fluoróforo solvatocrómico se usan indistintamente: esta convención está tan extendida que los proveedores los describen como sensibles al medio ambiente en lugar de solvatocrómicos.
Las fracciones fluorescentes emiten fotones varios nanosegundos después de la absorción siguiendo una curva de decaimiento exponencial, que difiere entre colorantes y depende del solvente circundante. Cuando el colorante se une a una macromolécula, la curva de decaimiento se vuelve multiexponencial. Los colorantes conjugados generalmente tienen una vida útil de entre 1 y 10 ns, existe una pequeña cantidad de excepciones de vida más larga, en particular el pireno con una vida útil de 400 ns en solventes desgasificados o 100 ns en lípidos y el coroneno con 200 ns. En una categoría diferente de fluoróforos están los organometales fluorescentes (lantánidos y complejos de metal de transición-ligando) que se han descrito previamente, que tienen vidas útiles mucho más largas debido a los estados restringidos: los lantánidos tienen vidas útiles de 0,5 a 3 ms, mientras que los complejos de metal de transición-ligando tienen vidas útiles de 10 ns a 10 μs. Tenga en cuenta que la vida útil de la fluorescencia no debe confundirse con la vida útil de la fotodestrucción o la "vida útil" de un tinte.
La excitación multifotón es una forma de enfocar el plano de visión del microscopio aprovechando el fenómeno en el que dos fotones simultáneos de baja energía son absorbidos por una fracción fluorescente que normalmente absorbe un fotón con el doble de su energía individual: digamos dos fotones NIR (800 nm) para excitar un colorante UV (400 nm).
Una fracción fluorescente perfectamente inmóvil, al exponerse a una luz polarizada, emitirá luz que también está polarizada. Sin embargo, si una molécula se mueve, tenderá a "desordenar" la polarización de la luz al irradiar en una dirección diferente a la de la luz incidente.
Algunas sustancias fluorescentes muestran una importante atenuación de la fluorescencia cuando se exponen a temperaturas cada vez mayores. Este efecto se ha utilizado para medir y examinar las propiedades termogénicas de las mitocondrias. Esto implica colocar fluoróforos termosensibles dirigidos a las mitocondrias dentro de las células, que se localizan naturalmente dentro de las mitocondrias debido a la carga negativa de la cara de la matriz de la membrana mitocondrial interna (ya que los fluoróforos son catiónicos). [14] La temperatura de estos fluoróforos es inversamente proporcional a su emisión de fluorescencia y, por lo tanto, midiendo la salida fluorescente, se puede deducir la temperatura de las mitocondrias que respiran activamente. Los fluoróforos utilizados son típicamente cationes lipofílicos derivados de la rodamina-B , [14] como las sondas MitoTracker de ThermoFisher . [15] Esta técnica ha contribuido significativamente al consenso científico general de que las mitocondrias se mantienen fisiológicamente a cerca de 50 ˚C, más de 10 ˚C por encima del resto de la célula. [16]
La relación inversa entre la fluorescencia y la temperatura se puede explicar por el cambio en el número de colisiones atómicas en el entorno del fluoróforo, dependiendo de la energía cinética. Las colisiones promueven la desintegración sin radiación y la pérdida de energía extra en forma de calor, por lo que más colisiones o colisiones más enérgicas promoverán la desintegración sin radiación y reducirán la emisión de fluorescencia. [17]
Sin embargo, esta técnica de medición de la temperatura es limitada. Estos fluoróforos catiónicos están muy influenciados por la carga de la cara matriz de la membrana mitocondrial interna, que depende del tipo de célula. Por ejemplo, el fluoróforo termosensible MTY (MitoTracker Yellow) muestra una caída repentina y drástica de la fluorescencia después de la adición de oligomicina (un inhibidor de la ATP sintasa ) a las mitocondrias de fibroblastos primarios humanos. Esto sugeriría un aumento brusco de la temperatura mitocondrial, pero en realidad se explica por la hiperpolarización de la membrana mitocondrial interna por la oligomicina, que conduce a la descomposición del fluoróforo MTY con carga positiva. [14]
Además, muchas moléculas biológicas tienen una fluorescencia intrínseca que a veces se puede utilizar sin necesidad de colocar una etiqueta química. A veces, esta fluorescencia intrínseca cambia cuando la molécula se encuentra en un entorno específico, por lo que se puede medir la distribución o la unión de la molécula. La bilirrubina , por ejemplo, es muy fluorescente cuando se une a un sitio específico en la albúmina sérica. La protoporfirina de zinc , que se forma en los glóbulos rojos en desarrollo en lugar de la hemoglobina cuando no hay hierro disponible o hay plomo presente, tiene una fluorescencia brillante y se puede utilizar para detectar estos problemas.
El número de aplicaciones de la fluorescencia en las ciencias biomédicas, biológicas y afines se expande continuamente. Los métodos de análisis en estos campos también están creciendo, a menudo con nomenclatura en forma de acrónimos como: FLIM , FLI, FLIP , CALI, FLIE , FRET , FRAP , FCS , PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP o TIRF . La mayoría de estas técnicas se basan en microscopios de fluorescencia, que utilizan fuentes de luz de alta intensidad, generalmente lámparas de mercurio o xenón, LED o láseres, para excitar la fluorescencia en las muestras bajo observación. Luego, los filtros ópticos separan la luz de excitación de la fluorescencia emitida para ser detectada a simple vista o con una cámara (CCD) u otro detector de luz (por ejemplo, tubos fotomultiplicadores, espectrógrafos). Se están realizando investigaciones considerables para mejorar las capacidades de dichos microscopios, las sondas fluorescentes utilizadas y las aplicaciones a las que se aplican. De particular interés son los microscopios confocales, que utilizan un orificio para lograr un seccionamiento óptico , lo que proporciona una vista cuantitativa en 3D de la muestra.