La replicación en horquilla rodante ( RHR ) es una forma unidireccional de desplazamiento de cadena de replicación de ADN utilizada por los parvovirus, un grupo de virus que constituyen la familia Parvoviridae . Los parvovirus tienen genomas de ADN monocatenario lineal (ssDNA) en los que la porción codificante del genoma está flanqueada por telómeros en cada extremo que forman bucles de horquilla . Durante la RHR, estos bucles de horquilla se despliegan y se vuelven a plegar repetidamente para cambiar la dirección de la replicación del ADN de modo que la replicación progrese de manera continua hacia adelante y hacia atrás a lo largo del genoma. La RHR es iniciada y terminada por una endonucleasa codificada por los parvovirus que se llama de diversas formas NS1 o Rep, y la RHR es similar a la replicación en círculo rodante , que es utilizada por los virus ssDNA que tienen genomas circulares.
Antes de que comience la replicación génica, una ADN polimerasa de la célula huésped convierte el genoma en una forma dúplex en la que la porción codificante es bicatenaria y está conectada a las horquillas terminales. A partir de ahí, el ARN mensajero (ARNm) que codifica la proteína iniciadora viral se transcribe y traduce para sintetizar la proteína. La proteína iniciadora comienza la replicación génica uniéndose y cortando el genoma en una región adyacente a una horquilla llamada origen y estableciendo una horquilla de replicación con su actividad helicasa . El corte hace que la horquilla se despliegue en una forma lineal y extendida. Luego, el telómero se replica y ambas hebras del telómero se pliegan sobre sí mismas a sus formas originales. Esto reposiciona la horquilla de replicación para cambiar las plantillas a la otra hebra y moverse en la dirección opuesta. Al llegar al otro extremo, ocurre el mismo proceso de despliegue, replicación y replegamiento.
Los parvovirus varían en si ambas horquillas son iguales o diferentes. Los parvovirus homoteloméricos como los virus adenoasociados (AAV), es decir, los que tienen telómeros idénticos o similares, tienen ambos extremos replicados por resolución terminal, el proceso descrito anteriormente. Los parvovirus heteroteloméricos como el virus diminuto de ratones (MVM), es decir, los que tienen telómeros diferentes, tienen un extremo replicado por resolución terminal y el otro por un proceso asimétrico llamado resolución de unión. Durante la resolución de unión asimétrica, la forma extendida dúplex del telómero se reorganiza en una unión en forma de cruciforme , y la orientación correcta del telómero se replica fuera del brazo inferior del cruciforme. Como resultado de RHR, se sintetiza una molécula replicativa que contiene numerosas copias de los genomas. La proteína iniciadora escinde periódicamente genomas de ssDNA de progenie de este concatémero replicativo.
Los parvovirus son una familia de virus ADN que tienen genomas de ADN monocatenario (ssDNA) encerrados en cápsides proteicas icosaédricas y resistentes de 18 a 26 nanómetros (nm) de diámetro. [1] A diferencia de la mayoría de los demás virus ssDNA, que tienen genomas circulares que forman un bucle, los parvovirus tienen genomas lineales con secuencias terminales cortas en cada extremo del genoma. Estos extremos pueden formarse en estructuras llamadas horquillas o bucles de horquilla y consisten en palíndromos cortos e imperfectos. [2] [3] La región codificante del genoma varía de un virus a otro y tiene una longitud de 4 a 6 kilobases (kb), y los extremos tienen una longitud de 116 a 550 nucleótidos (nt) cada uno. Las secuencias de horquilla proporcionan la mayor parte de la información que actúa en cis necesaria para la replicación y el empaquetamiento del ADN. [1] [4]
Los genomas de parvovirus pueden ser de sentido positivo o de sentido negativo . Algunas especies, como los virus adenoasociados (AAV) como AAV2, empaquetan un número aproximadamente igual de cadenas de sentido positivo y de sentido negativo en viriones, otros, como el virus diminuto de ratones (MVM), muestran preferencia por empaquetar cadenas de sentido negativo, y otros tienen proporciones variables. [4] Debido a esta disparidad, el extremo 5' (generalmente pronunciado "five prime end") de la cadena que codifica las proteínas no estructurales se llama "extremo izquierdo", y el extremo 3' (generalmente pronunciado "three prime end") se llama "extremo derecho". [3] En referencia a la cadena de sentido negativo, el extremo 3' es el lado izquierdo y el extremo 5' es el lado derecho. [4] [5]
Los parvovirus replican sus genomas a través de un proceso llamado replicación en horquilla rodante (RHR), que es una forma unidireccional de desplazamiento de cadena de la replicación del ADN. Antes de la replicación, la porción codificante del genoma de ssADN se convierte en una forma de ADN de doble cadena (dsADN), que luego es escindida por una proteína viral para iniciar la replicación. El desdoblamiento y replegamiento secuencial de los extremos de la horquilla actúa para invertir la dirección de la síntesis, lo que permite que la replicación se realice de ida y vuelta a lo largo del genoma para sintetizar un intermediario de ADN en forma replicativa dúplex (RF) continuo. Luego, los genomas de ssADN de la progenie se escinden del intermediario RF. [4] [6] Si bien los aspectos generales de la RHR se conservan en todos los géneros y especies, es probable que los detalles exactos varíen. [7]
Los genomas de parvovirus tienen puntos de inicio de replicación distintos que contienen secuencias de ADN palindrómicas. Estas secuencias pueden alternar entre pares de bases inter e intracatenarias a lo largo de la replicación, y sirven como telómeros autocebantes en cada extremo del genoma. [2] También contienen dos sitios clave necesarios para la replicación utilizados por la proteína iniciadora: un sitio de unión y un sitio de escisión. [8] Las secuencias de telómeros tienen una complejidad y diversidad significativas, lo que sugiere que realizan funciones adicionales para muchas especies. [1] [9] En MVM, por ejemplo, la horquilla del extremo izquierdo contiene sitios de unión para factores de transcripción que modulan la expresión génica de un promotor adyacente . Para AAV, las horquillas pueden unirse a complejos MRE11/Rad50/NBS1 (MRN) y heterodímeros Ku70/80, que están involucrados en la detección y reparación del ADN. [5] Sin embargo, en general tienen la misma estructura básica: palíndromos imperfectos en los que una región con pares de bases completos o principalmente pares de bases termina en una simetría axial. Estos palíndromos pueden plegarse en una variedad de estructuras, como una estructura en forma de Y y una estructura en forma de cruz. Durante la replicación, los extremos actúan como bisagras en las que las regiones con pares de bases imperfectos o parcialmente pares de bases que rodean el eje proporcionan un entorno favorable para el despliegue y replegamiento de la horquilla. [2] [3] [4]
Algunos parvovirus, como el AAV2, son homoteloméricos, lo que significa que los dos telómeros palindrómicos son similares o idénticos y forman parte de secuencias de repetición terminal ((I)TR) más grandes (invertidas). Por lo tanto, la replicación en cada terminación terminal es similar. Otros parvovirus, como el MVM, son heteroteloméricos, lo que significa que tienen dos telómeros físicamente diferentes. Como resultado, los parvovirus heteroteloméricos tienden a tener un proceso de replicación más complejo ya que los dos telómeros tienen diferentes procesos de replicación. [2] [3] [4] En general, los parvovirus homoteloméricos replican ambos extremos a través de un proceso llamado resolución terminal, mientras que los parvovirus heteroteloméricos replican un extremo por resolución terminal y el otro extremo por un proceso asimétrico llamado resolución de unión. [4] [5] [6] [10] En la siguiente tabla se muestra si un género es hetero- u homotelomérico, junto con otras características genómicas. [4]
Todo el proceso de replicación de horquilla rodante, que tiene etapas secuenciales distintas, se puede resumir de la siguiente manera: [4] [5] [7]
Al entrar en la célula, un anclaje de unos 24 nucleótidos de longitud que une la proteína viral NS1, esencial para la replicación, al virión se desprende del virión para volver a unirse más tarde. [3] Después de la entrada en la célula, los viriones se acumulan en el núcleo celular mientras el genoma todavía está contenido dentro de la cápside. Estas cápsides pueden reconfigurarse a un estado abierto o de transición durante la entrada. El mecanismo exacto por el cual el genoma sale de la cápside no está claro. [9] En el caso del AAV, se ha sugerido que los factores nucleares desmontan la cápside, mientras que en el caso del MVM, parece como si el genoma fuera expulsado en una dirección de 3′ a 5′ desde una abertura en la cápside llamada portal. [5]
Los parvovirus carecen de genes capaces de inducir a las células en reposo a entrar en su fase de síntesis de ADN (fase S). Además, es probable que el ssDNA desnudo sea inestable, percibido como extraño por la célula huésped o replicado incorrectamente por la reparación del ADN del huésped. Por estas razones, el genoma debe convertirse rápidamente a su forma dúplex menos obstructiva y más estable o retenerse dentro de la cápside hasta que se desproteja durante la fase S. Por lo general, esto último ocurre y el virión permanece silencioso en el núcleo hasta que la célula huésped entra en la fase S por sí sola. Durante este período de espera, los viriones pueden hacer uso de ciertas estrategias para evadir los mecanismos de defensa del huésped para proteger sus horquillas y ADN para alcanzar la fase S, [9] aunque no está claro cómo ocurre esto. [4] Dado que el genoma está empaquetado como ssDNA, la creación de una cadena complementaria es necesaria antes de la expresión génica . [5] [9]
Las ADN polimerasas solo pueden sintetizar ADN en una dirección de 5′ a 3′ y requieren un cebador de par de bases para comenzar la síntesis. Los parvovirus abordan estas limitaciones utilizando sus extremos como cebadores para la síntesis de la cadena complementaria. [9] Un extremo hidroxilo 3′ del extremo izquierdo (3′) se empareja con una base interna para preparar la síntesis inicial de ADN, lo que da como resultado la conversión del genoma de ssDNA a su primera forma dúplex. [1] [7] Esta es una molécula de ADN bicatenario monomérico en la que las dos cadenas están unidas covalentemente entre sí en el extremo izquierdo por una sola copia del telómero viral. La síntesis de la forma dúplex precede a la expresión de NS1 de modo que cuando la horquilla de replicación durante la síntesis inicial de la cadena complementaria alcanza el extremo derecho (5′), no desplaza ni copia la horquilla del extremo derecho. Esto permite que el extremo 3′ de la nueva cadena de ADN se una de forma covalente al extremo 5′ de la horquilla derecha mediante una ligasa del hospedador, creando así la molécula dúplex. Durante este paso, se resintetiza la secuencia de anclaje que estaba presente antes de la entrada del virus en la célula. [6]
Una vez que una célula infectada entra en la fase S, los genomas del parvovirus se convierten a su forma dúplex por la maquinaria de replicación del huésped, y el ARNm que codifica las proteínas no estructurales (NS) se transcribe a partir de un promotor viral (P4 para MVM). [4] [5] [9] Una de estas proteínas NS generalmente se llama NS1, pero también Rep1 o Rep68/78 para el género Dependoparvovirus , al que pertenece AAV. [4] NS1 es una proteína de unión al ADN específica del sitio que actúa como proteína iniciadora de la replicación [9] a través de la actividad de nickasa. [15] También media la escisión de ambos extremos del genoma de los intermediarios RF dúplex a través de una reacción de transesterificación que introduce una mella en secuencias de origen dúplex específicas. [4] Los componentes clave de NS1 incluyen un dominio de endonucleasa HUH hacia el extremo N de la proteína y una helicasa de la superfamilia 3 (SF3) hacia el extremo C , [16] así como la actividad de ATPasa. [1] Se une al ssDNA, al ARN y, de forma específica en el sitio del ADN dúplex, en reiteraciones de la secuencia de tetranucleótidos 5′-ACCA-3′ 1–3 . [1] [9] Estas secuencias están presentes en los sitios de origen de la replicación viral y se repiten en múltiples sitios a lo largo del genoma en formas más o menos degenerativas. [15]
NS1 corta el telómero del extremo derecho cerrado covalentemente a través de una reacción de transesterificación que libera un nucleótido 3' con pares de bases como un hidroxilo libre (-OH). [4] Esta reacción es asistida por una proteína de unión al ADN del huésped de la familia del grupo de alta movilidad 1/2 (HMG1/2) y se realiza en el origen de replicación, OriR , que fue creado por secuencias en la horquilla derecha e inmediatamente adyacentes a ella. El telómero del extremo izquierdo de MVM, un parvovirus heterotelomérico, contiene secuencias que pueden dar lugar a orígenes de replicación en intermediarios dúplex de orden superior, pero estas secuencias son inactivas en el extremo de la horquilla de la molécula monomérica, por lo que NS1 siempre inicia la replicación en el extremo derecho. [6]
El 3'-OH que se libera al cortar actúa como un cebador para que la ADN polimerasa comience la síntesis de la cadena complementaria [8] mientras que NS1 permanece unido covalentemente al extremo 5' a través de un residuo de tirosina . [1] En consecuencia, una copia de NS1 permanece unida al extremo 5' de todo el ADN de RF y progenie durante la replicación, el empaquetamiento y la liberación del virión. [4] [6] NS1 solo puede unirse a este sitio específico ensamblándose en homodímeros o multímeros de orden superior, lo que sucede naturalmente con la adición de trifosfato de adenosina (ATP) que probablemente esté mediado por el dominio de helicasa de NS1. Los estudios in vivo han demostrado que NS1 puede formarse en una variedad de estados oligoméricos, pero lo más probable es que se ensamble en hexámeros para cumplir las funciones tanto del dominio de endonucleasa como del dominio de helicasa. [15]
A partir de la ubicación en la muesca, se cree que NS1 organiza una horquilla de replicación y actúa como la helicasa replicativa 3' a 5'. Cerca de su extremo C, NS1 contiene un dominio de activación transcripcional ácido. Este dominio actúa para regular positivamente la transcripción a partir de un promotor viral (P38 para MVM) cuando NS1 se une a una serie de motivos 5'-ACCA-3', llamados secuencia tar , ubicados aguas arriba (hacia el extremo 5') de la unidad promotora, y a través de la interacción con NS1 y varios factores de transcripción. [15] NS1 también recluta el complejo de proteína A de replicación celular (RPA), que es esencial para establecer la nueva horquilla de replicación y para unir y estabilizar las hebras individuales desplazadas. [6]
Si bien NS1 es la única proteína no estructural esencial para todos los parvovirus, algunos tienen otras proteínas individuales que son esenciales para la replicación. En el caso del MVM, NS2 parece reprogramar la célula huésped para lograr una eficiente amplificación del ADN, síntesis de progenie monocatenaria, ensamblaje de la cápside y exportación del virión, aunque parece no tener una participación directa en estos procesos. NS2 se acumula inicialmente hasta tres veces más rápido que NS1 en la fase S temprana, pero se renueva rápidamente mediante una vía mediada por el proteasoma. A medida que avanza el ciclo infeccioso, NS2 se vuelve menos común a medida que la transcripción impulsada por P38 se vuelve más prominente. [15] Otro ejemplo es la fosfoproteína nuclear NP1 de los bocavirus, que, si no se sintetiza, da como resultado genomas de progenie no viables. [5]
A medida que las proteínas NS virales se acumulan, se apoderan de los aparatos de replicación de la célula huésped, terminando la síntesis de ADN de la célula huésped y haciendo que comience la amplificación del ADN viral. La interferencia con la replicación del ADN del huésped puede deberse a efectos directos sobre las proteínas de replicación del huésped que no son esenciales para la replicación viral, por un corte extenso del ADN del huésped o por la reestructuración del núcleo durante la infección viral. Al principio de la infección, los parvovirus establecen focos de replicación en el núcleo que se denominan cuerpos de replicación autónoma asociada al parvovirus (APAR). NS1 se co-localiza con el ADN viral replicante en estas estructuras con otras proteínas celulares necesarias para la síntesis de ADN viral, [15] mientras que otros complejos no necesarios para la replicación son secuestrados de los cuerpos APAR. La manera exacta por la cual las proteínas son incluidas o excluidas de los cuerpos APAR no está clara y parece variar de una especie a otra y entre tipos de células. [5] A medida que progresa la infección, los microdominios APAR comienzan a fusionarse con otros cuerpos nucleares, anteriormente distintos, para formar inclusiones nucleares progresivamente más grandes donde ocurre la replicación viral y el ensamblaje del virión. Una vez que comienza la fase S, la célula huésped se ve obligada a sintetizar ADN viral y no puede abandonar la fase S. [17]
La horquilla del extremo derecho de MVM contiene 248 nucleótidos [10] organizados en forma cruciforme. [1] Esta región tiene pares de bases casi perfectos, con solo tres bases no apareadas en el eje y una región desapareada ubicada a 20 nucleótidos del eje. Una inserción de tres nucleótidos, AGA o TCT, en una hebra separa pares opuestos de sitios de unión de NS1, creando un palíndromo de 36 pares de bases que puede asumir una configuración cruciforme alternativa. Se espera que esta configuración desestabilice el dúplex, lo que facilita su capacidad de funcionar como bisagra. El desapareamiento de las bases no apareadas, en lugar de la secuencia de tres nucleótidos en sí, puede ayudar a promover la inestabilidad del ADN dúplex. [10]
Las formas lineales completamente dúplex de la secuencia de horquilla del extremo derecho también funcionan como orígenes dependientes de NS1. Sin embargo, para muchos telómeros parvovirales, solo se requiere un sitio de unión del iniciador junto al sitio de corte para la función de origen, de modo que las secuencias mínimas requeridas para el corte tienen una longitud de menos de 40 pares de bases. Para MVM, el origen mínimo del extremo derecho tiene una longitud de alrededor de 125 pares de bases e incluye la mayor parte de la secuencia de horquilla porque están involucrados al menos tres elementos de reconocimiento: el sitio de corte 5′-CTWWTCA-3′ (elemento 1), ubicado siete nucleótidos aguas arriba de un sitio de unión NS1 dúplex (elemento 2) que está orientado para tener el complejo NS1 unido extendiéndose sobre el sitio de corte, y un segundo sitio de unión NS1 (elemento 3), que está adyacente al eje de la horquilla. [10]
El segundo sitio de unión está a más de 100 pares de bases del sitio de la mella, pero es necesario para la escisión mediada por NS1. [10] In vivo , hay una ligera variación en la posición de la mella, más o menos un nucleótido, con una posición preferida. Durante la mella, este sitio probablemente esté expuesto como una sola hebra y se estabilice potencialmente como un tallo-bucle mínimo por las repeticiones invertidas de tetranucleótidos a los lados del sitio. Las formas óptimas del sitio de unión de NS1 contienen al menos tres copias en tándem de la secuencia 5'-ACCA-3'. Las alteraciones modestas de estos motivos solo tienen un pequeño efecto en la afinidad, lo que sugiere que cada motivo de tetranucleótido es reconocido por diferentes moléculas en el complejo NS1. El sitio de unión de NS1 que posiciona a NS1 sobre el sitio de la mella en el origen del extremo derecho es un sitio de alta afinidad. [18]
Con ATP, NS1 se une asimétricamente a la secuencia antes mencionada, protegiendo una región de 41 pares de bases de longitud de la digestión. Esta huella se extiende solo cinco nucleótidos más allá del extremo 3' de la repetición ACCA, pero 22 nucleótidos más allá del extremo 5', de modo que la huella termina 15 nucleótidos más allá del sitio de corte, colocando a NS1 en posición de cortar el origen. El corte solo ocurre si el segundo sitio de unión de NS1, distante, también está presente en el origen y todo el complejo se activa mediante la adición de HMG1. [18]
En ausencia de NS1, HMG1 se une a la secuencia de horquilla de forma independiente, haciendo que se doble, sin proteger ninguna región de la digestión. HMG1 también puede unirse directamente a NS1 y media las interacciones entre las moléculas de NS1 unidas a sus elementos de reconocimiento en el origen, por lo que es esencial para la formación del complejo de escisión. La capacidad de la región del eje para reconfigurarse en una cruciforme no parece ser importante en este proceso. La escisión depende del espaciado correcto de los elementos del origen, por lo que las adiciones y eliminaciones pueden ser letales, mientras que las sustituciones pueden ser toleradas. La adición de HMG1 parece ajustar solo ligeramente las secuencias protegidas por NS1, pero la conformación del ADN intermedio cambia, plegándose en un bucle de doble hélice que se extiende unos 30 pares de bases a través de un elemento rico en guanina en el tallo de la horquilla. Entre este elemento y el sitio de la muesca hay cinco residuos de timidina incluidos en el bucle, y el sitio tiene una región a su lado que contiene muchos residuos de adenina y timina alternados , lo que probablemente aumenta la flexibilidad. La creación del bucle probablemente permite que el extremo terminal asuma una estructura tridimensional específica necesaria para activar la nickasa, ya que los orígenes que no logran reconfigurarse en un bucle de doble hélice una vez que se agrega HMG1 no sufren muescas. [18]
Después del corte, se establece una horquilla de replicación en el nucleótido 3′ recién expuesto que procede a desplegarse y copiar la horquilla del extremo derecho a través de una serie de reacciones de fusión y reasociación. [9] [18] Este proceso comienza una vez que NS1 corta el extremo interior de la horquilla original. Luego, la secuencia terminal se copia en la dirección opuesta, lo que produce una copia invertida de la secuencia original. [9] El resultado final es un extremo terminal de forma extendida dúplex que contiene dos copias de la secuencia terminal. [18] Si bien NS1 es necesaria para esto, no está claro si el despliegue está mediado por su actividad de helicasa frente a la horquilla o por la desestabilización del dúplex después de la unión del ADN en uno de sus sitios de reconocimiento 5′-(ACCA) n -3′. [6] Este proceso generalmente se denomina resolución terminal, pero también transferencia de horquilla o resolución de horquilla. [6] [9] La resolución terminal ocurre con cada ronda de replicación, por lo que los genomas de la progenie contienen un número igual de cada orientación terminal. Las dos orientaciones se denominan "flip" y "flop", [5] [6] y pueden representarse como R y r, o B y b, para el flip y flop del telómero del extremo derecho y L y l, o A y a, para el flip y flop del telómero del extremo izquierdo. [7] [19] Dado que los palíndromos terminales parvovirales son imperfectos, es fácil identificar qué orientación es cuál. [1]
Los telómeros dúplex de forma extendida generados durante la resolución terminal se funden, mediada por NS1 con hidrólisis de ATP , lo que hace que las hebras individuales se replieguen sobre sí mismas para crear estructuras de horquilla en forma de "orejas de conejo" que tienen los extremos invertidos. Esto requiere la actividad de la helicasa NS1, así como su actividad de unión específica del sitio, la última de las cuales permite que NS1 se una a copias simétricas de los sitios de unión de NS1 que rodean el eje del extremo de forma extendida. [10] [20]
La formación de orejas de conejo permite que el nucleótido 3′ de la cadena de ADN recién sintetizada se empareje con una base interna, lo que reposiciona la horquilla de replicación en una maniobra de cambio de cadena que prepara la síntesis de secuencias lineales adicionales. [10] El cambio de la síntesis de ADN a la formación de orejas de conejo al final de la resolución terminal puede requerir diferentes tipos de complejos NS1. Alternativamente, el complejo NS1 puede permanecer intacto durante este cambio, estando listo para comenzar la síntesis por desplazamiento de la cadena después del replegamiento en orejas de conejo. [20] Después de que se reposiciona la horquilla de replicación, la replicación continúa hacia el extremo izquierdo, utilizando la cadena de ADN recién sintetizada como plantilla. [7]
En el extremo izquierdo del genoma, es probable que se requiera NS1 para desplegar la horquilla. NS1 parece estar directamente involucrada en la fusión y reconfiguración de los dúplex del extremo izquierdo de forma extendida resultantes en estructuras de oreja de conejo, aunque esta reacción parece ser menos eficiente que en el extremo derecho. Los concatémeros dímeros y tetraméricos del genoma se generan sucesivamente para MVM. En estos concatémeros, los genomas de longitud unitaria alternantes se fusionan a través de una unión palindrómica en orientaciones de extremo izquierdo a extremo izquierdo y de extremo derecho a extremo derecho. [1] [10] En total, RHR da como resultado que las secuencias codificantes del genoma se copien con el doble de frecuencia que los extremos. [1] [7] [10] Tanto las configuraciones lineales como en horquilla del telómero del extremo derecho respaldan la iniciación de RHR, por lo que la resolución de las uniones dúplex de extremo derecho a extremo derecho puede ocurrir simétricamente en la secuencia dúplex de pares de bases o después de que este complejo se funda y se reconfigure en dos horquillas. No está claro cuál de estas dos reacciones es más común, ya que ambas parecen producir resultados idénticos. [20]
En el caso del AAV, cada telómero tiene una longitud de 125 bases y es capaz de plegarse en una horquilla con forma de T. El AAV contiene un gen Rep que codifica cuatro proteínas Rep, dos de las cuales, Rep68 y Rep78, actúan como proteínas iniciadoras de la replicación y cumplen las mismas funciones, como las actividades de nickasa y helicasa, que NS1. Reconocen y se unen a una secuencia (GAGC) 3 en la región del tallo del extremo terminal y cortan un sitio a 20 bases de distancia denominado trs . El mismo proceso de resolución terminal que MVM se realiza para el AAV, pero en ambos extremos. Las otras dos proteínas Rep, Rep52 y Rep40, no participan en la replicación del ADN, pero sí en la síntesis de la progenie. La replicación del AAV depende de un virus auxiliar que es un adenovirus o un herpesvirus que coinfecta la célula. En ausencia de coinfección, el genoma del AAV se integra en el ADN de la célula huésped hasta que se produce la coinfección. [1]
Una regla general es que los parvovirus con extremos idénticos, es decir, los parvovirus homoteloméricos como AAV y B19, replican ambos extremos por resolución terminal, generando un número igual de volteretas y volteretas de cada telómero. [1] [4] [6] Los parvovirus que tienen extremos diferentes, es decir, los parvovirus heteroteloméricos como MVM, replican un extremo por resolución terminal y el otro extremo por resolución de unión asimétrica, lo que conserva una orientación de secuencia única y requiere diferentes arreglos estructurales y cofactores para activar la nickasa de NS1. [4] [10] Los intermediarios de ADN de AAV que contienen cadenas sentido y antisentido unidas covalentemente producen concatémeros genómicos en condiciones desnaturalizantes, lo que indica que la replicación de AAV también sintetiza concatémeros dúplex que requieren alguna forma de resolución de unión. [10]
En los genomas MVM de sentido negativo, la horquilla del extremo izquierdo tiene 121 nucleótidos de longitud y existe en una única orientación de secuencia invertida. Este telómero tiene forma de Y y contiene pequeños palíndromos internos que se pliegan en las "orejas" de la Y, una región de tallo dúplex de 43 nucleótidos de longitud que está interrumpida por un residuo de timidina asimétrico y una secuencia de "burbuja" no coincidente en la que la secuencia 5′-GAA-3′ en el brazo interior es opuesta a la 5′-GA-3′ en la hebra exterior. [1] [20] Las secuencias en esta horquilla están involucradas tanto en la replicación como en la regulación de la transcripción. Los elementos involucrados en estas dos funciones separan los dos brazos de la horquilla. [20]
El telómero del extremo izquierdo del MVM, y probablemente de todos los parvovirus heteroteloméricos, no puede funcionar como un origen de replicación en su configuración de horquilla. En cambio, se crea un único origen en la cadena inferior cuando la horquilla se desdobla, se extiende y se copia para formar una secuencia de pares de bases dúplex que abarca genomas adyacentes en el dímero RF. Dentro de esta estructura, la secuencia del brazo externo que rodea un dinucleótido GA/TC [1] sirve como un origen, OriL TC . La secuencia GAA/TTC equivalente en el brazo interno que contiene el trinucleótido burbuja, llamado OriL GAA , no sirve como un origen. El brazo interno y la configuración de horquilla del extremo parecen funcionar como elementos de control ascendentes para el promotor transcripcional viral P4. Además, la capacidad de segregar un brazo del corte parece esencial para la replicación. [20]
El origen lineal mínimo del extremo izquierdo tiene una longitud de aproximadamente 50 pares de bases y se extiende desde dos motivos 5′-ACGT-3′, separados por cinco nucleótidos en un extremo, hasta una posición siete pares de bases más allá del sitio de la mella. La secuencia GA de la burbuja en sí es relativamente poco importante, pero el espacio que ocupa es necesario para que el origen funcione. [1] [20] Dentro del origen, hay tres secuencias de reconocimiento: un sitio de unión a NS1 que orienta el complejo NS1 sobre el sitio de la mella 5′-CTWWTCA-3′, que se encuentra 17 nucleótidos corriente abajo (hacia el extremo 3′), y los dos motivos ACGT. Estos motivos se unen a un factor celular heterodimérico llamado factor de iniciación del parvovirus (PIF) o proteína de unión al elemento modulador de glucocorticoides (GMEB). [21]
PIF es un complejo heterodimérico de unión al ADN de sitio específico que contiene dos subunidades, p96 y p79, y funciona como un modulador de la transcripción en la célula huésped. Se une al ADN a través de un pliegue KDWK y reconoce dos semisitios ACGT. El espaciamiento entre estos sitios puede variar significativamente para PIF, de uno a nueve nucleótidos, con un espaciamiento óptimo de seis. PIF estabiliza la unión de NS1 en la forma activa del origen del extremo izquierdo, OriL TC , pero no en la forma inactiva, OriL GAA , porque los dos complejos pueden establecer contacto sobre el binucleótido burbuja. La horquilla del extremo izquierdo de todas las demás especies del género Protoparvovirus , [nota 6] al que pertenece MVM, tienen asimetrías de burbuja y sitios de unión de PIF, aunque con una ligera variación en el espaciamiento. Esto sugiere que todos comparten un mecanismo de segregación de origen similar. [21]
Debido a la ubicación del origen activo OriL TC en la unión del dímero, la síntesis de nuevas copias de la horquilla del extremo izquierdo en la orientación correcta, es decir, el flequillo, no es sencilla, ya que una horquilla de replicación que se mueve desde este sitio a través de la estructura de puente lineal debería sintetizar ADN nuevo en la orientación del flequillo. En cambio, la unión del dímero MVM del lado izquierdo se resuelve de forma asimétrica en un proceso que crea un intermedio cruciforme. Esta maniobra logra dos cosas: permite la síntesis del nuevo ADN en la orientación de secuencia correcta y crea una estructura que puede ser resuelta por NS1. Este modelo "heterocruciforme" de síntesis sugiere que la resolución está impulsada por la actividad de la helicasa NS1 y depende de la inestabilidad inherente del palíndromo dúplex, una propiedad que le permite cambiar entre sus configuraciones lineal y cruciforme. [21]
NS1 introduce inicialmente una muesca monocatenaria en OriL TC en el brazo B ("derecho") de la unión y se une covalentemente al ADN en el lado 5' de la muesca, exponiendo un nucleótido 3' emparejado con bases. A continuación, pueden producirse dos resultados, dependiendo de la velocidad con la que se ensamble una horquilla de replicación. Si el ensamblaje es rápido, entonces, mientras la unión está en su configuración lineal, la síntesis de "lectura continua" copia la hebra superior, lo que regenera la unión dúplex y desplaza una hebra de sentido positivo que retroalimenta el grupo replicativo. Esto promueve la amplificación del ADN MVM, pero no conduce a la síntesis de nuevas secuencias terminales en la orientación correcta ni a la resolución de la unión. [22]
Para crear una estructura resoluble, el corte inicial debe ir seguido de la fusión y reorganización de la unión del dímero en una cruciforme. Esto es impulsado por la actividad de la helicasa 3' a 5' del complejo NS1 unido a 5'. Una vez que esta cruciforme se extiende para incluir secuencias más allá del sitio de corte, el cebador expuesto en el sitio de corte en OriL TC experimenta un cambio de plantilla al anillarse con su complemento en el brazo inferior de la cruciforme. Si una horquilla se ensambla después de este punto, entonces la síntesis posterior se despliega y copia el brazo cruciforme inferior. Esto crea un intermedio heterocruciforme que contiene el telómero recién sintetizado en la orientación de la secuencia invertida que está unida a la hebra inferior del brazo B. [22] Esta unión modificada se llama MJ2. [23]
El brazo inferior de MJ2 es un palíndromo dúplex de forma extendida que es esencialmente idéntico a los generados durante la resolución terminal. Una vez que se sintetiza MJ2, el brazo inferior se vuelve susceptible a la formación de orejas de conejo. Esto reposiciona el nucleótido 3' de la copia recién sintetizada del brazo inferior de modo que se empareje con secuencias internas en el brazo B de la unión para iniciar la síntesis por desplazamiento de cadena. Si se crea una horquilla de replicación en este nucleótido 3', entonces se copia la cadena inferior del brazo B, creando una unión intermedia llamada MJ1 y desplazando progresivamente la cadena superior. Esto conduce a la liberación de la secuencia B-ta (B-ta) recién sintetizada. El cruciforme residual, llamado δJ, es parcialmente monocatenario en la parte superior del brazo B y contiene la cadena superior intacta de la unión emparejada con la cadena inferior del brazo A ("izquierdo"), con una copia intacta de la horquilla del extremo izquierdo, que termina en un complejo NS1 5'. Dado que δJ transporta la helicasa NS1, se presume que altera periódicamente su configuración. [22] [23]
El siguiente paso es menos seguro, pero se puede inferir en base a lo que se sabe sobre el proceso hasta ahora. Se espera que la helicasa NS1 cree una estructura dinámica en la que el sitio de corte en δJ en el lado A normalmente inactivo se exponga temporal pero repetidamente en una forma monocatenaria durante los reordenamientos de dúplex a horquilla, lo que permite que NS1 se una al sitio de corte en el GAA OriL de origen sin la ayuda de un cofactor. El corte dejaría a NS1 unido covalentemente a la cadena "B" de sentido positivo de δJ y conduciría a la liberación de esta cadena. El corte también deja abierto un nucleótido 3' de pares de bases en la cadena "A" de δJ para iniciar la síntesis de ADN. Si se establece una horquilla de replicación aquí, entonces la cadena A se desdobla y se copia para crear su forma extendida de dúplex. [23]
Cuando los genomas MVM se replican in vivo , la mella antes mencionada puede no ocurrir porque ambos extremos de la forma replicativa del dímero contienen un número eficiente de orígenes de horquilla del extremo derecho. Por lo tanto, las horquillas de replicación pueden progresar de nuevo hacia la unión del dímero desde el extremo derecho del genoma, copiando la hebra superior del brazo B antes de la mella de resolución final. Esto evita la resolución del puente del dímero y recicla la hebra superior en un grupo de dímeros dúplex replicantes. En un virus estrechamente relacionado, LuIII, la mella de cadena sencilla libera una hebra de sentido positivo con su horquilla del extremo izquierdo en la orientación flop. A diferencia de MVM, LuIII empaqueta hebras de ambos sentidos con igual frecuencia. En las hebras de sentido negativo, las horquillas del extremo izquierdo están todas en la orientación flip, mientras que en las hebras de sentido positivo, hay un número igual de orientaciones flip y flop. En comparación con MVM, LuIII contiene una inserción de dos bases inmediatamente a 3′ del sitio de corte en el origen derecho, lo que perjudica su eficiencia. Debido a esto, la eficiencia reducida del ensamblaje de la horquilla de replicación en el extremo derecho del genoma puede favorecer el corte de una sola cadena al darle más tiempo para que ocurra. [23]
Los genomas de progenie individuales se escinden de los concatémeros replicativos genómicos comenzando por introducir cortes en los orígenes de replicación, generalmente por la proteína iniciadora de la replicación. Esto da como resultado el establecimiento de nuevas horquillas de replicación que replican los telómeros en una combinación de resolución terminal y resolución de unión y desplazan genomas de ssDNA individuales de la molécula replicativa. [7] [20] Al final de este proceso, los telómeros se pliegan hacia adentro para formar horquillas en los genomas escindidos. Los extremos de forma extendida creados durante la escisión se parecen a las moléculas de forma extendida antes de la resolución terminal, por lo que se pueden fundir y volver a plegar en forma de orejas de conejo para rondas adicionales de replicación. [1] Por lo tanto, dentro de una célula infectada, pueden surgir numerosos concatémeros replicativos. [7]
El desplazamiento de los genomas de ssDNA de la progenie ocurre predominante o exclusivamente durante la replicación activa del ADN o cuando las células están ensamblando partículas virales. Por lo tanto, el desplazamiento de las hebras simples puede estar asociado con el empaquetamiento del ADN viral en cápsides. Investigaciones anteriores sugirieron que la partícula viral preensamblada puede secuestrar el genoma en una dirección de 5′ a 3′ a medida que se desplaza desde la horquilla, pero investigaciones más recientes sugieren que el empaquetamiento se realiza en una dirección de 3′ a 5′ impulsada por la helicasa NS1 utilizando hebras simples recién sintetizadas. [24]
No está claro si estas cadenas simples se liberan en el nucleoplasma de modo que los complejos de empaquetamiento están físicamente separados de los complejos de replicación o si los intermediarios de replicación sirven como sustratos tanto de replicación como de empaquetamiento. En el último caso, los genomas de la progenie recientemente desplazados se mantendrían en el complejo de replicación a través de interacciones entre sus moléculas NS1 unidas por el extremo 5′ y las proteínas NS1 o de la cápside que están asociadas físicamente con el ADN replicante. [24] Los genomas se insertan en la cápside a través de una entrada llamada portal situado en uno de los ejes icosaédricos de 5 pliegues de la cápside, [4] que posiblemente sea opuesto a la abertura por la que se expulsan los genomas al principio del ciclo de replicación. [5]
La selección de hebras para la encapsidación probablemente no involucra señales de empaquetamiento específicas, pero puede ser predecible mediante el modelo matemático de transferencia de horquilla cinética (KHT), que explica la distribución de las hebras y conformaciones terminales de los genomas empaquetados en términos de la eficiencia con la que cada tipo de extremo terminal puede experimentar reacciones que le permiten ser copiado y reformado. En otras palabras, el modelo KHT postula que la eficiencia relativa con la que se resuelven y replican dos extremos genómicos determina la distribución de los intermediarios de replicación amplificados creados durante la infección y, en última instancia, la eficiencia con la que se escinden los ssADN de polaridad y orientaciones terminales características, que luego se empaquetarán con la misma eficiencia. [4] [24]
La escisión preferencial de genomas particulares solo es aparente durante el empaquetamiento. Por lo tanto, entre los parvovirus que empaquetan cadenas de un sentido, la replicación parece ser bifásica. En los primeros tiempos, se escinden ambas cadenas de sentido. A esto le sigue un cambio en el modo de replicación que permite la síntesis exclusiva de un solo sentido para el empaquetamiento. Una forma modificada del modelo KHT, llamada modelo de desplazamiento preferencial de la cadena, propone que el cambio mencionado en la replicación es causado por el inicio del empaquetamiento porque el sustrato para el empaquetamiento es probablemente una molécula de ADN recién desplazada. [24] Para los parvovirus heteroteloméricos, el desequilibrio de la activación del origen conduce al desplazamiento preferencial de las cadenas de sentido negativo desde el origen del extremo derecho. Por lo tanto, la frecuencia relativa de las cadenas de sentido en los viriones empaquetados se puede utilizar para inferir el tipo de mecanismo de resolución utilizado durante la escisión. [5]
Poco después del inicio de la fase S, la traducción del ARNm viral conduce a la acumulación de proteínas de la cápside en el núcleo. Estas proteínas forman oligómeros que se ensamblan en cápsides vacías intactas. Después de la encapsidación, los viriones completos pueden exportarse desde el núcleo al exterior de la célula antes de la desintegración del núcleo. La alteración del entorno de la célula huésped también puede ocurrir más adelante en la infección. Esto da como resultado la lisis celular por necrosis o apoptosis , que libera viriones al exterior de la célula. [4] [17]
Muchos replicones pequeños que tienen genomas circulares, como los virus de ssADN circulares y los plásmidos circulares, se replican mediante replicación de círculo rodante (RCR), que es una forma unidireccional de desplazamiento de cadena de la replicación del ADN similar a la RHR. En la RCR, las rondas sucesivas de replicación, que se desarrollan en un bucle alrededor del genoma, se inician y terminan mediante cortes monocatenarios específicos del sitio hechos por una endonucleasa codificada por el replicón, llamada de diversas formas nickasa, relaxasa, proteína de movilización (mob), transesterasa o proteína de replicación (Rep). La proteína iniciadora de la replicación de los parvovirus está genéticamente relacionada con estas otras endonucleasas. [17]
Las proteínas iniciadoras de RCR contienen tres motivos que se consideran importantes para la replicación. Dos de ellos se conservan en las proteínas iniciadoras del parvovirus: un grupo HUHUUU, que se supone que se une a un Mg2+
ion necesario para el corte y un motivo YxxxK que contiene el residuo de tirosina del sitio activo que ataca el enlace fosfodiéster del ADN diana. A diferencia de las proteínas iniciadoras RCR, que pueden unir cadenas de ADN, las proteínas iniciadoras RHR solo tienen rastros vestigiales de ser capaces de realizar la ligadura. [17]
La replicación en cadena de ADN comienza cuando la proteína iniciadora corta una cadena de ADN en una secuencia específica en la región de origen de la replicación. Esto se hace a través de una reacción de transesterificación que forma un enlace fosfato 5' que conecta el ADN a la tirosina del sitio activo y libera el hidroxilo del extremo 3' (3'-OH) adyacente al sitio de corte. El extremo 3' se utiliza entonces como cebador para que la ADN polimerasa del huésped comience la replicación mientras la proteína iniciadora permanece unida al extremo 5' de la cadena "original". Después de un bucle de replicación alrededor del genoma circular, la proteína iniciadora regresa al sitio de corte, es decir, el complejo iniciador original, mientras todavía está unida a la cadena parental y ataca el sitio de corte dúplex regenerado, o un segundo sitio cercano en algunos casos, por medio de una reacción de corte-unión similar a la de la topoisomerasa . [17]
Durante la reacción antes mencionada, la proteína iniciadora corta un nuevo sitio de corte y se transfiere a través del enlace fosfodiéster análogo. De este modo, se une al nuevo extremo 5' mientras liga el extremo 5' de la primera cadena a la que estaba originalmente unida al extremo 3' de la misma cadena. Este segundo mecanismo varía según el replicón. Algunos replicones, como el virus ΦX174, contienen un segundo residuo de tirosina activo en la proteína iniciadora. Otros utilizan la tirosina del sitio activo análogo en una segunda proteína iniciadora que está presente como parte de un complejo de nickasa multimérico. [17]
Esta segunda reacción de corte puede ocurrir después de un bucle o pueden ocurrir bucles sucesivos en los que se crea un concatémero que contiene múltiples copias del genoma. El resultado de este corte es que los genomas desplazados se desprenden de la molécula replicativa. Estas copias del genoma se ligan y pueden encapsidarse en cápsides de progenie, siempre que sean monoméricas, o convertirse en una forma bicatenaria cerrada covalentemente por una ADN polimerasa del huésped para una mayor replicación. Mientras que la RHR generalmente implica la replicación de ambas cadenas sentido en un proceso continuo, la RCR tiene síntesis de cadena complementaria y síntesis de cadena genómica que ocurren por separado. [7]
Las estrategias utilizadas en RHR para activar el sitio de corte también están presentes en RCR. La mayoría de los orígenes de RCR están en forma de ADN dúplex que debe fundirse antes de cortarlo. Los iniciadores de RCR logran esto uniéndose a secuencias de unión de ADN específicas en el origen junto al sitio de inicio. [17] Luego, este último sitio se funde en un proceso que consume ATP y que es asistido por la capacidad de las hebras separadas para reconfigurarse en estructuras de tallo-bucle. En estas estructuras, el sitio de corte se presenta en un bucle expuesto. Al igual que las proteínas iniciadoras de RHR, muchas proteínas iniciadoras de RCR contienen actividad helicasa, que les permite fundir el ADN antes de cortarlo y servir como la helicasa 3′ a 5′ en la horquilla de replicación. [19]
{{cite journal}}: CS1 maint: DOI inactivo a partir de septiembre de 2024 ( enlace )