La reparación por escisión de bases ( BER ) es un mecanismo celular, estudiado en los campos de la bioquímica y la genética , que repara el ADN dañado a lo largo del ciclo celular. Es responsable principalmente de eliminar pequeñas lesiones de bases que no distorsionan la hélice del genoma. La vía de reparación por escisión de nucleótidos relacionada repara lesiones voluminosas que distorsionan la hélice. La BER es importante para eliminar bases dañadas que de otro modo podrían causar mutaciones por apareamiento incorrecto o provocar roturas en el ADN durante la replicación. La BER es iniciada por las glicosilasas de ADN , que reconocen y eliminan bases dañadas o inapropiadas específicas, formando sitios AP . Estos luego son escindidos por una endonucleasa AP . La rotura de cadena sencilla resultante puede luego ser procesada por BER de parche corto (donde se reemplaza un solo nucleótido) o de parche largo (donde se sintetizan de 2 a 10 nucleótidos nuevos). [1]
Las bases individuales del ADN pueden resultar dañadas químicamente por diversos mecanismos, siendo los más comunes la desaminación, la oxidación y la alquilación. Estas modificaciones pueden afectar la capacidad de la base para formar puentes de hidrógeno, lo que da lugar a un emparejamiento incorrecto de las bases y, como consecuencia, a mutaciones en el ADN. Por ejemplo, la incorporación de adenina en lugar de 8-oxoguanina (derecha) durante la replicación del ADN hace que un par de bases G:C mute a T:A. Otros ejemplos de lesiones de bases reparadas mediante BER son:
Además de las lesiones de base, los pasos posteriores del BER también se utilizan para reparar roturas de cadena sencilla.
Actualmente se está investigando la elección entre la reparación con parche corto y con parche largo. Se cree que varios factores influyen en esta decisión, incluido el tipo de lesión, la etapa del ciclo celular y si la célula está diferenciada terminalmente o en división activa. [3] Algunas lesiones, como los sitios de AP oxidados o reducidos, son resistentes a la actividad de la pol β liasa y, por lo tanto, deben procesarse mediante BER con parche largo.
La preferencia de la vía también puede diferir entre organismos. Mientras que las células humanas utilizan BER de parche corto y largo, durante mucho tiempo se creyó que la levadura Saccharomyces cerevisiae carecía de una vía de parche corto porque no tiene homólogos de varias proteínas de parche corto de mamíferos, incluyendo pol β, ADN ligasa III, XRCC1 y el dominio quinasa de PNKP . El reciente descubrimiento de que la polimerasa poli-A Trf4 posee actividad de liasa dRP 5' ha desafiado esta opinión. [4]
Las glicosilasas de ADN son responsables del reconocimiento inicial de la lesión. Hacen girar la base dañada fuera de la doble hélice, como se muestra en la imagen, y escinden el enlace N-glucosídico de la base dañada, dejando un sitio AP . Hay dos categorías de glicosilasas: monofuncionales y bifuncionales. Las glicosilasas monofuncionales solo tienen actividad de glicosilasa, mientras que las glicosilasas bifuncionales también poseen actividad de AP liasa . Por lo tanto, las glicosilasas bifuncionales pueden convertir una lesión de base en una rotura de cadena simple sin la necesidad de una endonucleasa AP . La β-eliminación de un sitio AP por una glicosilasa-liasa produce un aldehído 3' α,β-insaturado adyacente a un fosfato 5', que difiere del producto de escisión de la endonucleasa AP. [5] Algunas glicosilasas-liasas pueden realizar además una δ-eliminación, que convierte el aldehído 3' en un fosfato 3'. Se ha desarrollado una amplia variedad de glicosilasas para reconocer diferentes bases dañadas. Entre los ejemplos de glicosilasas de ADN se incluyen Ogg1 , que reconoce la 8-oxoguanina, MPG , que reconoce la 3-metiladenina, y UNG , que elimina el uracilo del ADN.
Las endonucleasas AP escinden un sitio AP para producir un hidroxilo 3' adyacente a un fosfato de desoxirribosa 5' (dRP). Las endonucleasas AP se dividen en dos familias según su homología con las endonucleasas AP bacterianas ancestrales, la endonucleasa IV y la exonucleasa III . [6] Muchos eucariotas tienen miembros de ambas familias, incluida la levadura Saccharomyces cerevisiae , en la que Apn1 es el homólogo de EndoIV y Apn2 está relacionado con ExoIII. En humanos, se han identificado dos endonucleasas AP, APE1 y APE2. [7] Es un miembro de la familia ExoIII.
Para que se produzca la ligadura, una rotura de cadena de ADN debe tener un hidroxilo en su extremo 3' y un fosfato en su extremo 5' . En los seres humanos, la polinucleótido quinasa-fosfatasa ( PNKP ) promueve la formación de estos extremos durante la BER. Esta proteína tiene un dominio quinasa, que fosforila los extremos hidroxilo 5', y un dominio fosfatasa, que elimina los fosfatos de los extremos 3'. Juntas, estas actividades preparan las roturas de cadena sencilla con extremos dañados para la ligadura. Las endonucleasas AP también participan en el procesamiento del extremo 3'. Además de abrir los sitios AP, poseen actividad fosfodiesterasa 3' y pueden eliminar una variedad de lesiones 3', incluidos fosfatos, fosfoglicolatos y aldehídos. El procesamiento 3' debe ocurrir antes de que pueda iniciarse la síntesis de ADN porque las ADN polimerasas requieren un hidroxilo 3' para extenderse.
La pol β es la principal polimerasa humana que cataliza la BER de parche corto, con pol λ capaz de compensar en su ausencia. [8] Estas polimerasas son miembros de la familia Pol X y típicamente insertan solo un único nucleótido. Además de la actividad polimerasa, estas enzimas tienen un dominio liasa que elimina el dRP 5' dejado atrás por la escisión de la endonucleasa AP. Durante la BER de parche largo, se cree que la síntesis de ADN está mediada por pol δ y pol ε junto con el factor de procesividad PCNA , las mismas polimerasas que llevan a cabo la replicación del ADN . Estas polimerasas realizan una síntesis de desplazamiento, lo que significa que el extremo 5' del ADN corriente abajo se "desplaza" para formar un colgajo (ver el diagrama anterior). La pol β también puede realizar una síntesis de desplazamiento de parche largo y, por lo tanto, puede participar en cualquiera de las vías de la BER. [9] La síntesis de parche largo típicamente inserta de 2 a 10 nucleótidos nuevos.
FEN1 elimina el colgajo 5' generado durante la BER de parche largo. Esta endonucleasa muestra una marcada preferencia por un colgajo 5' largo adyacente a un colgajo 3' de 1 nt. [10] El homólogo de levadura de FEN1 es RAD27 . Además de su función en la BER de parche largo, FEN1 corta colgajos con una estructura similar durante el procesamiento del fragmento de Okazaki , un paso importante en la replicación del ADN de cadena rezagada .
La ADN ligasa III junto con su cofactor XRCC1 cataliza el paso de sellado de la mella en la BER de parche corto en humanos. [11] [12] La ADN ligasa I liga la rotura en la BER de parche largo. [13]
Los defectos en una variedad de vías de reparación del ADN conducen a la predisposición al cáncer, y la BER parece seguir este patrón. Se ha demostrado que las mutaciones por deleción en los genes BER dan como resultado una mayor tasa de mutación en una variedad de organismos, lo que implica que la pérdida de BER podría contribuir al desarrollo del cáncer. De hecho, se han encontrado mutaciones somáticas en Pol β en el 30% de los cánceres humanos, y algunas de estas mutaciones conducen a la transformación cuando se expresan en células de ratón. [14] También se sabe que las mutaciones en la ADN glicosilasa MYH aumentan la susceptibilidad al cáncer de colon . [15]
Las alteraciones epigenéticas (epimutaciones) en genes de reparación por escisión de bases recién han comenzado a evaluarse en unos pocos tipos de cáncer, en comparación con los numerosos estudios previos de epimutaciones en genes que actúan en otras vías de reparación del ADN (como MLH1 en la reparación de desajustes y MGMT en la reversión directa). [ cita requerida ] A continuación se resumen algunos ejemplos de epimutaciones en genes de reparación por escisión de bases que ocurren en los cánceres.
La MBD4 (proteína 4 del dominio de unión a metil-CpG) es una glicosilasa empleada en un paso inicial de la reparación por escisión de bases. La proteína MBD4 se une preferentemente a los sitios CpG completamente metilados y a las bases de ADN alteradas en esos sitios. Estas bases alteradas surgen de la hidrólisis frecuente de citosina a uracilo (ver imagen) y la hidrólisis de 5-metilcitosina a timina, produciendo pares de bases G:U y G:T. [16] Si los uracilos o timinas inadecuados en estos pares de bases no se eliminan antes de la replicación del ADN, causarán mutaciones de transición . La MBD4 cataliza específicamente la eliminación de T y U emparejadas con guanina (G) dentro de los sitios CpG. [17] Esta es una función de reparación importante ya que aproximadamente 1/3 de todas las mutaciones intragénicas de un solo par de bases en cánceres humanos ocurren en dinucleótidos CpG y son el resultado de las transiciones de G:C a A:T. [17] [18] Estas transiciones comprenden las mutaciones más frecuentes en el cáncer humano. Por ejemplo, casi el 50% de las mutaciones somáticas del gen supresor de tumores p53 en el cáncer colorrectal son transiciones de G:C a A:T dentro de sitios CpG. [17] Por lo tanto, una disminución en la expresión de MBD4 podría causar un aumento en las mutaciones carcinógenas .
La expresión de MBD4 se reduce en casi todas las neoplasias colorrectales debido a la metilación de la región promotora de MBD4. [19] Además, MBD4 es deficiente debido a la mutación en aproximadamente el 4% de los cánceres colorrectales. [20]
La mayoría de los campos histológicamente normales que rodean crecimientos neoplásicos (adenomas y cánceres de colon) en el colon también muestran una expresión reducida del ARNm de MBD4 (un defecto de campo ) en comparación con el tejido histológicamente normal de individuos que nunca tuvieron una neoplasia colónica. [19] Este hallazgo sugiere que el silenciamiento epigenético de MBD4 es un paso temprano en la carcinogénesis colorrectal .
En una población china evaluada, el polimorfismo MBD4 Glu346Lys se asoció con una reducción de alrededor del 50% en el riesgo de cáncer de cuello uterino, lo que sugiere que las alteraciones en MBD4 pueden ser importantes en el cáncer. [21]
NEIL1 reconoce (se dirige a) y elimina ciertas bases dañadas oxidativamente y luego corta el sitio abásico a través de la eliminación β,δ, dejando los extremos fosfato 3' y 5'. NEIL1 reconoce pirimidinas oxidadas , formamidopirimidinas, residuos de timina oxidados en el grupo metilo y ambos estereoisómeros de timina glicol . [22] Los mejores sustratos para NEIL1 humano parecen ser las lesiones de hidantoína , guanidinohidantoína y espiroiminodihidantoína que son otros productos de oxidación de 8-oxoG . NEIL1 también es capaz de eliminar lesiones del ADN monocatenario, así como de estructuras de ADN en forma de burbuja y bifurcada. Una deficiencia en NEIL1 causa un aumento de la mutagénesis en el sitio de un par 8-oxo-Gua:C, y la mayoría de las mutaciones son transversiones de G:C a T:A. [23]
Un estudio de 2004 descubrió que el 46% de los cánceres gástricos primarios presentaban una expresión reducida del ARNm de NEIL1 , aunque no se conocía el mecanismo de reducción. [24] Este estudio también descubrió que el 4% de los cánceres gástricos presentaban mutaciones en NEIL1. Los autores sugirieron que la baja actividad de NEIL1 derivada de la expresión reducida y/o mutación en NEIL1 a menudo estaba involucrada en la carcinogénesis gástrica.
Se realizó un análisis de 145 genes de reparación de ADN para detectar la metilación aberrante del promotor en tejidos de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) de 20 pacientes y en muestras de mucosa de cabeza y cuello de 5 pacientes no oncológicos. [25] Este análisis mostró que NEIL1, con una hipermetilación sustancialmente aumentada, tenía la frecuencia de metilación más significativamente diferente. Además, la hipermetilación correspondía a una disminución en la expresión del ARNm de NEIL1. Un trabajo posterior con 135 tumores y 38 tejidos normales también mostró que el 71% de las muestras de tejido de HNSCC tenían una metilación elevada del promotor de NEIL1. [25]
Cuando se evaluaron 8 genes de reparación del ADN en tumores de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), el 42 % estaba hipermetilado en la región promotora NEIL1. [26] Esta fue la anomalía de reparación del ADN más frecuente encontrada entre los 8 genes de reparación del ADN evaluados. NEIL1 también fue uno de los seis genes de reparación del ADN que se encontraron hipermetilados en sus regiones promotoras en el cáncer colorrectal . [27]
La metilación y desmetilación activa del ADN es necesaria para el proceso cognitivo de formación y mantenimiento de la memoria . [29] En ratas, el condicionamiento del miedo contextual puede desencadenar la memoria de por vida para el evento con un solo ensayo, y los cambios de metilación parecen estar correlacionados con el desencadenamiento de recuerdos particularmente duraderos. [29] Con el condicionamiento del miedo contextual , después de 24 horas, el ADN aislado de la región del hipocampo del cerebro de la rata tenía 2097 genes metilados de manera diferencial, y una proporción estaba desmetilada. [29] Como revisaron Bayraktar y Kreutz, [28] la desmetilación del ADN depende de la reparación por escisión de bases (ver figura).
El ejercicio físico tiene efectos beneficiosos bien establecidos sobre el aprendizaje y la memoria (ver Efectos neurobiológicos del ejercicio físico ). El BDNF es un regulador particularmente importante del aprendizaje y la memoria. [30] Como revisaron Fernandes et al., [31] en ratas, el ejercicio mejora la expresión del gen Bdnf en el hipocampo , que tiene un papel esencial en la formación de la memoria. La expresión mejorada de Bdnf ocurre a través de la desmetilación de su promotor de isla CpG en el exón IV [31] y la desmetilación depende de la reparación por escisión de bases (ver figura). [28]
La actividad de la ADN glicosilasa que elimina las bases metiladas en los leucocitos humanos disminuye con la edad. [32] La reducción en la escisión de bases metiladas del ADN sugiere una disminución dependiente de la edad en la ADN glicosilasa de 3-metiladenina , una enzima BER responsable de eliminar las bases alquiladas. [32]
Las ratas jóvenes (de 4 a 5 meses de edad), pero no las ratas viejas (de 24 a 28 meses de edad), tienen la capacidad de inducir la ADN polimerasa beta y la endonucleasa AP en respuesta al daño oxidativo. [33]