La reparación de errores de coincidencia de ADN ( MMR ) es un sistema para reconocer y reparar la inserción, eliminación e incorporación errónea de bases que pueden surgir durante la replicación y recombinación del ADN , así como para reparar algunas formas de daño en el ADN . [1] [2]
La reparación de desajustes es específica de cada hebra. Durante la síntesis de ADN, la cadena (hija) recién sintetizada comúnmente incluirá errores. Para comenzar la reparación, la maquinaria de reparación de desajustes distingue la hebra recién sintetizada de la plantilla (parental). En las bacterias gramnegativas, la hemimetilación transitoria distingue las hebras (la parental está metilada y la hija no). Sin embargo, en otros procariotas y eucariotas, el mecanismo exacto no está claro. Se sospecha que, en eucariotas, el ADN de cadena retardada recién sintetizado contiene muescas de manera transitoria (antes de ser sellado por la ADN ligasa) y proporciona una señal que dirige los sistemas de corrección de errores de coincidencia a la cadena apropiada. Esto implica que estas mellas deben estar presentes en la hebra principal, y recientemente se ha encontrado evidencia de esto. [3] Un trabajo reciente [4] ha demostrado que las mellas son sitios para la carga dependiente de RFC de la abrazadera deslizante de replicación, el antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), de una manera específica de orientación, de modo que una cara de la proteína con forma de rosquilla está yuxtapuesto hacia el extremo 3'-OH en la mella. Luego, el PCNA cargado dirige la acción de la endonucleasa MutLalpha [5] a la cadena hija en presencia de una falta de coincidencia y MutSalpha o MutSbeta.
Cualquier evento mutacional que altere la estructura superhélice del ADN conlleva el potencial de comprometer la estabilidad genética de una célula. El hecho de que los sistemas de detección y reparación de daños sean tan complejos como la propia maquinaria de replicación pone de relieve la importancia que la evolución ha otorgado a la fidelidad del ADN.
Ejemplos de bases no coincidentes incluyen un emparejamiento G/T o A/C (consulte Reparación de ADN ). Los desajustes suelen deberse a la tautomerización de bases durante la replicación del ADN. El daño se repara reconociendo la deformidad causada por el desajuste, determinando la cadena plantilla y no plantilla, y extirpando la base mal incorporada y reemplazándola con el nucleótido correcto . El proceso de eliminación implica algo más que el propio nucleótido no coincidente. Se pueden eliminar unos pocos o hasta miles de pares de bases de la cadena de ADN recién sintetizada.
La reparación de desajustes es un proceso altamente conservado desde procariotas hasta eucariotas . La primera evidencia de reparación de desajustes se obtuvo de S. pneumoniae (los genes hexA y hexB ). Trabajos posteriores sobre E. coli han identificado una serie de genes que, cuando se inactivan mutacionalmente , causan cepas hipermutables. Por lo tanto, los productos genéticos se denominan proteínas "Mut" y son los principales componentes activos del sistema de reparación de errores de coincidencia. Tres de estas proteínas son esenciales para detectar el desajuste y dirigir la maquinaria de reparación hacia él: MutS , MutH y MutL (MutS es un homólogo de HexA y MutL de HexB).
MutS forma un dímero (MutS 2 ) que reconoce la base no coincidente en la cadena hija y se une al ADN mutado. MutH se une a sitios hemimetilados a lo largo del ADN hijo, pero su acción es latente, siendo activada sólo al contacto con un dímero de MutL (MutL 2 ), que se une al complejo MutS-ADN y actúa como mediador entre MutS 2 y MutH, activando el último. El ADN se enrolla para buscar el sitio de metilación d(GATC) más cercano al desajuste, que podría estar a hasta 1 kb de distancia. Tras la activación por el complejo MutS-ADN, MutH corta la cadena hija cerca del sitio hemimetilado. MutL recluta helicasa UvrD (ADN Helicasa II) para separar las dos hebras con una polaridad específica de 3' a 5'. Luego, todo el complejo MutSHL se desliza a lo largo del ADN en la dirección del desajuste, liberando la hebra para ser extirpada a medida que avanza. Una exonucleasa sigue el complejo y digiere la cola del ADN-ss. La exonucleasa reclutada depende de en qué lado del desajuste MutH incide en la hebra: 5' o 3'. Si la mella hecha por MutH está en el extremo 5' del desajuste, se utiliza RecJ o ExoVII (ambas exonucleasas 5' a 3'). Sin embargo, si la mella está en el extremo 3' del desajuste, se utiliza ExoI (una enzima de 3' a 5').
Todo el proceso termina más allá del sitio de discordancia, es decir, tanto el sitio mismo como los nucleótidos circundantes se extirpan por completo. La brecha monocatenaria creada por la exonucleasa puede luego repararse con la ADN polimerasa III (asistida por una proteína de unión monocatenaria), que utiliza la otra hebra como plantilla, y finalmente sellarse con la ADN ligasa. Luego, la ADN metilasa metila rápidamente la cadena hija.
Cuando se une, el dímero MutS 2 dobla la hélice del ADN y protege aproximadamente 20 pares de bases. Tiene una actividad ATPasa débil y la unión de ATP conduce a la formación de estructuras terciarias en la superficie de la molécula. La estructura cristalina de MutS revela que es excepcionalmente asimétrica y, si bien su conformación activa es un dímero, solo una de las dos mitades interactúa con el sitio de desajuste.
En eucariotas, los homólogos M ut S forman dos heterodímeros principales: Msh2 /Msh6 (MutSα) y Msh2 /Msh3 (MutSβ). La vía MutSα participa principalmente en la sustitución de bases y la reparación de desajustes de bucle pequeño. La vía MutSβ también participa en la reparación de bucles pequeños, además de en la reparación de bucles grandes (~10 bucles de nucleótidos). Sin embargo, MutSβ no repara las sustituciones de bases.
MutL también tiene una actividad ATPasa débil (utiliza ATP para moverse). Forma un complejo con MutS y MutH, aumentando la huella de MutS en el ADN.
Sin embargo, la procesividad (la distancia que la enzima puede recorrer a lo largo del ADN antes de disociarse) de UvrD es sólo de ~40 a 50 pb. Debido a que la distancia entre la muesca creada por MutH y el desajuste puede promediar ~600 pb, si no hay otro UvrD cargado, la sección desenrollada queda libre para volver a recocerse con su hebra complementaria, lo que obliga al proceso a comenzar de nuevo. Sin embargo, cuando cuenta con la ayuda de MutL, la tasa de carga de UvrD aumenta considerablemente. Si bien la procesividad (y la utilización de ATP) de las moléculas individuales de UvrD sigue siendo la misma, el efecto total sobre el ADN aumenta considerablemente; el ADN no tiene posibilidad de volver a hibridarse, ya que cada UvrD desenrolla entre 40 y 50 pb de ADN, se disocia y luego es inmediatamente reemplazado por otro UvrD, repitiendo el proceso. Esto expone grandes secciones de ADN a la digestión con exonucleasa , lo que permite una rápida escisión (y posterior reemplazo) del ADN incorrecto.
Los eucariotas tienen cinco homólogos de M ut L designados como MLH1, MLH2, MLH3, PMS1 y PMS2. Forman heterodímeros que imitan a MutL en E. coli . Los homólogos humanos de MutL procariótico forman tres complejos denominados MutLα, MutLβ y MutLγ. El complejo MutLα está formado por las subunidades MLH1 y PMS2, el heterodímero MutLβ está formado por MLH1 y PMS1, mientras que MutLγ está formado por MLH1 y MLH3. MutLα actúa como una endonucleasa que introduce roturas de cadena en la cadena hija tras la activación por falta de coincidencia y otras proteínas requeridas, MutSα y PCNA. Estas interrupciones de cadena sirven como puntos de entrada para una actividad exonucleasa que elimina el ADN no coincidente. Los papeles desempeñados por MutLβ y MutLγ en la reparación de desajustes son menos comprendidos.
MutH es una endonucleasa muy débil que se activa una vez unida a MutL (que a su vez está unida a MutS). Corta el ADN no metilado y la cadena no metilada del ADN hemimetilado, pero no corta el ADN completamente metilado. Los experimentos han demostrado que la reparación de desajustes es aleatoria si ninguna de las cadenas está metilada. [ cita necesaria ] Estos comportamientos llevaron a la propuesta de que MutH determina qué cadena contiene la falta de coincidencia. MutH no tiene homólogo eucariota. Su función endonucleasa es asumida por homólogos de MutL, que tienen cierta actividad exonucleasa 5'-3' especializada. La tendencia de la cadena para eliminar los desajustes de la cadena hija recién sintetizada en eucariotas puede ser proporcionada por los extremos 3' libres de los fragmentos de Okazaki en la nueva cadena creada durante la replicación.
PCNA y la abrazadera deslizante β se asocian con MutSα/β y MutS, respectivamente. Aunque los informes iniciales sugirieron que el complejo PCNA-MutSα puede mejorar el reconocimiento de discordancias, [6] se ha demostrado recientemente [7] que no hay ningún cambio aparente en la afinidad de MutSα por una discordancia en presencia o ausencia de PCNA. Además, los mutantes de MutSα que no pueden interactuar con PCNA in vitro exhiben la capacidad de llevar a cabo el reconocimiento de errores de coincidencia y la escisión de errores de coincidencia hasta niveles cercanos al tipo salvaje. Dichos mutantes son defectuosos en la reacción de reparación dirigida por una rotura de la cadena 5', lo que sugiere por primera vez que MutSα funciona en un paso de la reacción posterior a la escisión.
Las mutaciones en los homólogos humanos de las proteínas Mut afectan la estabilidad genómica, lo que puede provocar inestabilidad de microsatélites (IMS), implicada en algunos cánceres humanos. En concreto, los cánceres colorrectales hereditarios sin poliposis ( HNPCC o síndrome de Lynch) se atribuyen a variantes dañinas de la línea germinal en los genes que codifican los homólogos de MutS y MutL, MSH2 y MLH1 , respectivamente, que, por tanto, se clasifican como genes supresores de tumores. Un subtipo de HNPCC, el síndrome de Muir-Torre (MTS), está asociado con tumores de piel. Si ambas copias heredadas (alelos) de un gen MMR contienen variantes genéticas dañinas, se produce una afección muy rara y grave: el síndrome del cáncer de reparación de desajustes (o deficiencia constitucional de reparación de desajustes, CMMR-D), que se manifiesta como múltiples apariciones de tumores en una edad temprana, a menudo tumores de colon y cerebro . [8]
Los cánceres esporádicos con una deficiencia en la reparación del ADN rara vez tienen una mutación en un gen de reparación del ADN, pero en cambio tienden a tener alteraciones epigenéticas , como la metilación del promotor, que inhiben la expresión del gen de reparación del ADN. [9] Alrededor del 13% de los cánceres colorrectales tienen deficiencias en la reparación de errores de coincidencia del ADN, comúnmente debido a la pérdida de MLH1 (9,8%) o, a veces, MSH2, MSH6 o PMS2 (todos ≤1,5%). [10] Para la mayoría de los cánceres colorrectales esporádicos con deficiencia de MLH1, la deficiencia se debió a la metilación del promotor MLH1. [10] Otros tipos de cáncer tienen frecuencias más altas de pérdida de MLH1 (consulte la tabla a continuación), que nuevamente son en gran medida el resultado de la metilación del promotor del gen MLH1 . Un mecanismo epigenético diferente que subyace a las deficiencias de MMR podría implicar la sobreexpresión de un microARN; por ejemplo, los niveles de miR-155 se correlacionan inversamente con la expresión de MLH1 o MSH2 en el cáncer colorrectal. [11]
Un defecto de campo (cancerización de campo) es un área del epitelio que ha sido precondicionada por cambios epigenéticos o genéticos, predisponiéndola al desarrollo de cáncer. Como señaló Rubin "...hay evidencia de que más del 80% de las mutaciones somáticas encontradas en tumores colorrectales humanos con fenotipo mutador ocurren antes del inicio de la expansión clonal terminal". [20] [21] De manera similar, Vogelstein et al. [22] señalan que más de la mitad de las mutaciones somáticas identificadas en tumores ocurrieron en una fase preneoplásica (en un defecto de campo), durante el crecimiento de células aparentemente normales.
Las deficiencias de MLH1 eran comunes en los defectos de campo (tejidos histológicamente normales) que rodeaban a los tumores; consulte la tabla anterior. MLH1 epigenéticamente silenciado o mutado probablemente no conferiría una ventaja selectiva a una célula madre; sin embargo, causaría mayores tasas de mutación y uno o más de los genes mutados pueden proporcionar a la célula una ventaja selectiva. El gen MLH1 deficiente podría luego ser transportado como un gen pasajero selectivamente casi neutral (autoestopista) cuando la célula madre mutada genera un clon expandido. La presencia continua de un clon con un MLH1 epigenéticamente reprimido continuaría generando más mutaciones, algunas de las cuales podrían producir un tumor.
Inicialmente se observó que la MMR y las mutaciones de reparación de desajustes se asociaban con la eficacia del bloqueo de los puntos de control inmunológico en un estudio que examinó a los respondedores al anti-PD1. [23] La asociación entre la positividad de MSI y la respuesta positiva al anti-PD1 fue validada posteriormente en un ensayo clínico prospectivo y aprobada por la FDA. [24]
En los seres humanos, siete proteínas de reparación de errores de coincidencia del ADN (MMR) ( MLH1 , MLH3 , MSH2 , MSH3 , MSH6 , PMS1 y PMS2 ) funcionan de manera coordinada en pasos secuenciales para iniciar la reparación de los errores de coincidencia del ADN. [25] Además, existen subvías MMR dependientes e independientes de Exo1. [26]
Otros productos genéticos implicados en la reparación de errores de coincidencia (posterior a la iniciación por genes MMR) en humanos incluyen la ADN polimerasa delta , PCNA , RPA , HMGB1 , RFC y ADN ligasa I , además de factores modificadores de histonas y cromatina . [27] [28]
En determinadas circunstancias, la vía MMR puede reclutar una ADN polimerasa eta ( POLH ) propensa a errores. Esto sucede en los linfocitos B durante la hipermutación somática , donde se utiliza POLH para introducir variación genética en los genes de los anticuerpos. [29] Sin embargo, esta vía MMR propensa a errores puede activarse en otros tipos de células humanas tras la exposición a genotoxinas [30] y, de hecho, es ampliamente activa en varios cánceres humanos, causando mutaciones que llevan una firma de actividad POLH. [31]
Reconocer y reparar desajustes e indeles es importante para las células porque no hacerlo da como resultado inestabilidad de microsatélites (MSI) y una tasa elevada de mutación espontánea (fenotipo mutador). En comparación con otros tipos de cáncer, el cáncer con deficiencia de MMR (MSI) tiene una frecuencia muy alta de mutaciones, similar al melanoma y al cáncer de pulmón, [32] tipos de cáncer causados por una gran exposición a la radiación ultravioleta y a sustancias químicas mutagénicas.
Además de una carga de mutaciones muy alta, las deficiencias de MMR dan como resultado una distribución inusual de mutaciones somáticas en todo el genoma humano: esto sugiere que MMR protege preferentemente las regiones eucromaticas ricas en genes y de replicación temprana. [33] Por el contrario, las regiones del genoma heterocromático de replicación tardía y pobres en genes exhiben altas tasas de mutación en muchos tumores humanos. [34]
La modificación de histona H3K36me3 , una marca epigenética de la cromatina activa, tiene la capacidad de reclutar el complejo MSH2-MSH6 (hMutSα). [35] Consistentemente, las regiones del genoma humano con altos niveles de H3K36me3 acumulan menos mutaciones debido a la actividad MMR. [31]
La falta de MMR a menudo ocurre en coordinación con la pérdida de otros genes reparadores del ADN. [9] Por ejemplo, los genes MMR MLH1 y MLH3 , así como otros 11 genes de reparación del ADN (como MGMT y muchos genes de la vía NER ) estaban significativamente regulados a la baja en astrocitomas de grado inferior y superior , en contraste con el cerebro normal. tejido. [36] Además, la expresión de MLH1 y MGMT estuvo estrechamente correlacionada en 135 muestras de cáncer gástrico y la pérdida de MLH1 y MGMT pareció acelerarse sincrónicamente durante la progresión del tumor. [37]
La expresión deficiente de múltiples genes de reparación del ADN se encuentra a menudo en los cánceres [9] y puede contribuir a las miles de mutaciones que generalmente se encuentran en los cánceres (consulte Frecuencias de mutaciones en los cánceres ).
Una idea popular, que no ha logrado obtener un apoyo experimental significativo, es la idea de que la mutación, a diferencia del daño al ADN, es la causa principal del envejecimiento. Los ratones defectuosos en el homólogo de mutL Pms2 tienen una frecuencia de mutación aproximadamente 100 veces mayor en todos los tejidos, pero no parecen envejecer más rápidamente. [38] Estos ratones muestran un desarrollo y una vida en su mayoría normales, excepto por la carcinogénesis de inicio temprano y la infertilidad masculina.
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