Una prueba puntual en liquenología es un análisis puntual que se utiliza para ayudar a identificar líquenes . Se realiza colocando una gota de un reactivo químico en diferentes partes del liquen y anotando el cambio de color (o la falta de él) asociado con la aplicación del químico. Las pruebas se encuentran rutinariamente en claves dicotómicas para especies de líquenes y aprovechan la amplia gama de productos de líquenes ( metabolitos secundarios ) producidos por los líquenes y su singularidad entre los taxones . Como tal, las pruebas puntuales revelan la presencia o ausencia de químicos en varias partes de un liquen. Fueron propuestas por primera vez como un método para ayudar a identificar especies por el liquenólogo finlandés William Nylander en 1866. [1]
Tres pruebas puntuales comunes utilizan una solución acuosa de KOH al 10% (prueba K), una solución acuosa saturada de polvo blanqueador o hipoclorito de calcio (prueba C) o una solución alcohólica de p -fenilendiamina al 5% (prueba P). Los cambios de color se producen debido a la presencia de metabolitos secundarios particulares en el liquen. En la literatura de referencia clave de identificación, el resultado de las pruebas puntuales químicas sirve como una característica primaria para determinar las especies de líquenes. Hay varias otras pruebas puntuales menos utilizadas de uso más limitado que se emplean en situaciones específicas, como para distinguir entre ciertas especies. Las variaciones de la técnica, incluido el uso de papel de filtro para mejorar la visibilidad de las reacciones o el examen bajo un microscopio , se adaptan a diferentes tipos de líquenes y pigmentaciones, y los resultados generalmente se resumen con un código corto que indica la sustancia y la reacción observada. Otros métodos de diagnóstico, como la exposición a la luz ultravioleta (UV), pueden ayudar a identificar los metabolitos del liquen y distinguir entre especies, ya que algunas sustancias fluorescen bajo la luz UV, lo que ayuda a la diferenciación de especies estrechamente relacionadas.
Las pruebas de cuatro puntos se utilizan con mayor frecuencia para ayudar a identificar el liquen. [3]
El reactivo para la prueba K es una solución acuosa de hidróxido de potasio (KOH) (10–25%), o, en ausencia de KOH, una solución acuosa al 10% de hidróxido de sodio (NaOH, lejía), que proporciona resultados casi idénticos. [4] Una solución al 10% de KOH conservará su eficacia durante unos 6 meses a un año. [5] La prueba depende de la formación de sal y requiere la presencia de al menos un grupo funcional ácido en la molécula. Los compuestos de liquen que contienen una quinona como parte de su estructura producirán un color rojo oscuro a violeta. Los compuestos de ejemplo incluyen los pigmentos que son antraquinonas , naftoquinonas y terfenilquinonas . Los colores amarillo a rojo se producen con la prueba K y algunos depsidos (incluidos atranorina y ácido tánlico ), y muchas depsidonas β- orcinol . Por el contrario, las xantonas , los derivados del ácido pulvínico y el ácido úsnico no tienen ninguna reacción. [4]
Algunos líquenes comunes y ampliamente distribuidos que tienen productos liquénicos con una reacción positiva al K incluyen Xanthoria parietina , que es K+ (rojo-púrpura) debido a la parietina (una antraquinona), y Dibaeis baeomyces , que es K+ (amarillo), debido al compuesto didepside ácido baeomycesico. [6]
Esta prueba utiliza una solución saturada de hipoclorito de calcio (polvo blanqueador) o, alternativamente, una solución diluida (se suele utilizar un 5,25 %) de hipoclorito de sodio o lejía doméstica sin diluir . Estas soluciones suelen sustituirse a diario, ya que se descomponen en un plazo de 24 a 48 horas; se descomponen incluso más rápidamente cuando se exponen a la luz solar (menos de una hora), por lo que se recomienda guardarlas en una botella de color oscuro. Otros factores que aceleran la descomposición de estas soluciones son el calor, la humedad y el dióxido de carbono . [7]
Los colores que se observan típicamente con la prueba C son rojo y naranja-rosa. Los productos químicos que causan una reacción roja incluyen ácido anziáico , eritrina y ácido lecanórico , mientras que aquellos que resultan en rojo anaranjado incluyen ácido girofórico. [8] En raras ocasiones, se produce un color verde esmeralda, causado por la reacción con dihidroxi dibenzofuranos , [9] como el producto químico estrepsilina . [8] Otro color raro producido por esta prueba es amarillo, que se observa con Cladonia portentosa como resultado del ácido úsnico dibenzofurano. [10]
Algunos líquenes comunes y ampliamente distribuidos que tienen productos liquénicos con una reacción positiva al C incluyen Lecanora expallens , que es C+ (naranja) debido al ácido tiofánico xantona, y Diploschistes muscorum , que es C+ (rojo) debido al ácido diploschistésico didepside. [10]
Esta prueba también se conoce como la prueba P. Utiliza una solución etanólica de para -fenilendiamina (PD) al 1-5%, hecha colocando una gota de etanol (70-95%) sobre unos pocos cristales de la sustancia química; esto produce una solución inestable y sensible a la luz que dura aproximadamente un día. [11] Una forma alternativa de esta solución, llamada solución de Steiner, dura mucho más, aunque produce reacciones de color menos intensas. Por lo general, se prepara disolviendo 1 gramo de PD, 10 gramos de sulfito de sodio y 0,5 mililitros de detergente en 100 mililitros de agua; inicialmente de color rosa, la solución se vuelve violeta con el tiempo. La solución de Steiner durará meses. [5] La fenilendiamina reacciona con aldehídos para producir bases de Schiff de acuerdo con la siguiente reacción: [9]
Los productos de esta reacción son de color amarillo a rojo. La mayoría de las depsidonas de β-orcinol y algunas depsidas de β-orcinol reaccionarán positivamente. [11] La prueba de PD, conocida por su alta especificidad hacia sustancias que producen reacciones de K+ amarillas o rojas, ha reemplazado en gran medida a la prueba de K más simple pero menos concluyente. [12] La PD es venenosa tanto en forma de polvo como de solución, y las superficies que entran en contacto con ella (incluida la piel) se decoloran. [13]
Algunos líquenes comunes y ampliamente distribuidos que tienen productos liquénicos con una reacción positiva al P incluyen Parmelia subrudecta , que es PD+ (amarillo) debido al didepside atranorin, y Hypogymnia physodes , que es PD+ (naranja) debido al ácido fisodálico depsidona. [14]
Esta prueba puntual se puede realizar humedeciendo el talo con K seguido inmediatamente de C. La aplicación inicial de K rompe (a través de hidrólisis ) los enlaces éster en dépsides y depsidonas. Si se libera un grupo hidroxilo fenólico que es meta a otro hidroxilo, entonces se produce un color rojo a naranja cuando se aplica C. [15] El ácido alectorónico y el ácido fisódico producen este color, mientras que se produce un color violeta cuando está presente el ácido picroliquénico. La prueba CK es una variación menos utilizada que invierte el orden de aplicación de los productos químicos. Se utiliza en casos especiales cuando se prueba el color naranja producido por el ácido bárbato o el ácido difractaico , como el presente en Cladonia floerkeana . [8] El yodo de Lugol es otro reactivo que puede ser útil para identificar ciertas especies. [16]
Hypogymnia tubulosa es un liquen que es KC+ (naranja-rosa) debido al ácido fisódico depsidona; Cetrelia olivetorum es KC+ (rosa-rojo) debido al ácido alectorónico depsidona. [10]
Hay varias pruebas puntuales que se utilizan con poca frecuencia debido a su aplicabilidad limitada, pero que pueden ser útiles en situaciones en las que es necesario detectar metabolitos específicos de líquenes o para distinguir entre ciertas especies cuando otras pruebas son negativas.
Las pruebas puntuales se realizan colocando una pequeña cantidad del reactivo deseado en la parte del liquen que se va a analizar. A menudo, se analizan tanto la corteza como la médula del liquen y, a veces, es útil analizar otras estructuras, como la soralia . Un método consiste en extraer una pequeña cantidad del producto químico en un capilar de vidrio y tocarlo con el talo del liquen; también se utiliza un pincel pequeño para este propósito. Las reacciones se visualizan mejor con una lupa o un microscopio estereoscópico . [8] Se puede utilizar una hoja de afeitar para retirar la corteza y acceder a la médula. Alternativamente, la solución se puede aplicar a las características del liquen que carecen de corteza o que dejan la médula expuesta, como la soralia, las pseudociphellae o la parte inferior de las escamosas. [19]
En una variación de esta técnica, sugerida por el químico sueco Johan Santesson, [20] se utiliza un trozo de papel de filtro para intentar que la reacción de color sea más fácilmente observable. El fragmento de liquen se presiona sobre el papel y las sustancias del liquen se extraen con 10-20 gotas de acetona. Después de evaporar la acetona, las sustancias del liquen se dejan sobre el papel en un anillo alrededor del fragmento de liquen. El papel de filtro se puede probar entonces de la forma habitual. [21] En los casos en los que los resultados de una prueba puntual en el talo son inciertos, es posible aplastar una sección delgada del tejido en un portaobjetos de microscopio en una cantidad mínima de agua y reactivo debajo de un cubreobjetos. Un cambio de color es visible bajo un objetivo de microscopio de baja potencia , o cuando el portaobjetos se coloca contra un fondo blanco. [8] Esta técnica es útil cuando se prueban líquenes con pigmentos oscuros, como Bryoria . [5]
Las pruebas puntuales se pueden utilizar de forma individual o en combinación. Los resultados de una prueba puntual se representan normalmente con un código corto que incluye, en orden, (1) una letra que indica el reactivo utilizado, (2) un signo "+" o "−" que indica un cambio de color o la ausencia de cambio de color, respectivamente, y (3) una letra o palabra que indica el color observado. Además, se debe tener cuidado de indicar qué parte del liquen se ha analizado. Por ejemplo, "Cortex K+ orange, C−, P−" significa que la corteza de la muestra de prueba se volvió naranja con la aplicación de KOH y no cambió con la lejía o la para -fenilendiamina. De forma similar, "Medulla K−, KC+R" indicaría que la médula del liquen era insensible a la aplicación de KOH, pero la aplicación de KOH seguida inmediatamente de lejía hizo que la médula se volviera roja. [12]
En ocasiones, la reacción de color tarda un tiempo en desarrollarse. Por ejemplo, en ciertas especies de Cladonia , la reacción de PD con ácido fumarprotocetrárico puede tardar hasta medio minuto. [13] En cambio, las reacciones con C y KC suelen ser fugaces y se producen en el plazo de un segundo tras la aplicación del reactivo, por lo que es fácil pasar por alto un cambio de color. Existen varias razones posibles por las que no se produce un resultado de prueba previsto. Las causas incluyen reactivos viejos y químicamente inactivos y bajas concentraciones de sustancias de líquenes en la muestra. Si el color del talo es oscuro, es posible que no se produzca un cambio de color y otras técnicas sean más apropiadas, como la técnica del papel de filtro. [8]
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A veces puede ser útil realizar otras medidas de diagnóstico además de las pruebas puntuales. Por ejemplo, algunos metabolitos de líquenes fluorescen bajo la radiación ultravioleta , de modo que la exposición de ciertas partes del liquen a una fuente de luz ultravioleta puede revelar la presencia o ausencia de esos metabolitos de manera similar a las pruebas puntuales. Ejemplos de sustancias de líquenes que dan una fluorescencia brillante en UV son los ácidos alectorónico, lobárico y divaricático, y la liquexantona . En algunos casos, la prueba de luz ultravioleta se puede utilizar para ayudar a distinguir entre especies estrechamente relacionadas, como Cladonia deformis (UV−) y Cladonia sulphurina (UV+, debido a la presencia de ácido escamoso). [19] Solo la luz ultravioleta de longitud de onda larga es útil para observar líquenes directamente. [5]
Las técnicas analíticas más avanzadas, como la cromatografía de capa fina , la cromatografía líquida de alto rendimiento y la espectrometría de masas, también pueden ser útiles para caracterizar inicialmente la composición química de los líquenes o cuando las pruebas puntuales no son reveladoras. [23]
En general, se considera que el liquenólogo finlandés William Nylander fue el primero en demostrar el uso de sustancias químicas para ayudar a identificar los líquenes. [24] En artículos publicados en 1866, sugirió pruebas puntuales con KOH y polvo blanqueador para obtener reacciones de color características, típicamente amarillo, rojo o verde. [1] [25] [26] En estos estudios, demostró, por ejemplo, que los líquenes ahora conocidos como Cetrelia cetrarioides y C. olivetorum podían distinguirse como especies distintas debido a sus diferentes reacciones de color: C+ rojo en el último, en contraste con ninguna reacción en el primero. Nylander demostró cómo se podía utilizar KOH para distinguir entre las especies similares Xanthoria candelaria y Candelaria concolor porque la presencia de parietina en la primera especie da como resultado una fuerte reacción de color. También sabía que en algunos casos los químicos del liquen no se distribuían uniformemente por toda la corteza y la médula debido a las diferentes reacciones de color en estas áreas. [24] A mediados de la década de 1930, Yasuhiko Asahina creó la prueba con para -fenilendiamina, que produce reacciones de amarillo a rojo con metabolitos secundarios que tienen un grupo aldehído libre. [27] [28] Más tarde se demostró que esta prueba puntual era particularmente útil en la taxonomía de la familia Cladoniaceae . [29] [24]