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proteasa TEV

La proteasa TEV ( EC 3.4.22.44, Tobacco Etch Virus nuclear-inclusion-a endopeptidasa ) es una cisteína proteasa altamente específica de secuencia del Tobacco Etch Virus (TEV). [1] Es un miembro del clan PA de proteasas similares a la quimotripsina . [2] Debido a su alta especificidad de secuencia, la proteasa TEV se utiliza con frecuencia para la escisión controlada de proteínas de fusión in vitro e in vivo . [3] La secuencia consenso reconocida por la proteasa TEV es Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-|-Ser, donde "|" denota enlace peptídico escindido . [4]

Origen

El virus del grabado del tabaco codifica todo su genoma como una única poliproteína masiva (350 kDa). Este se escinde en unidades funcionales mediante tres proteasas: proteasa P1 (1 sitio de escisión), proteasa del componente auxiliar (1 sitio de escisión) y proteasa TEV (7 sitios de escisión). [1] La proteasa TEV nativa también contiene un sitio de autoescisión interno. Este sitio se escinde lentamente para inactivar la enzima (se desconoce la razón fisiológica de esto).

Estructura y función

Estructura de la proteasa TEV. Los dobles barriles β que definen la superfamilia están resaltados en rojo. ( PDB : 1lvm ​)

La estructura de la proteasa TEV se ha resuelto mediante cristalografía de rayos X. [5] Está compuesto por dos barriles β y una cola C-terminal flexible y muestra homología estructural con la superfamilia de proteasas de quimotripsina ( clan PA , familia C4 según la clasificación MEROPS ). [2] Aunque es homóloga a las serina proteasas celulares (como tripsina , elastasa , trombina , etc.), la proteasa TEV utiliza una cisteína como su nucleófilo catalítico [6] (al igual que muchas otras proteasas virales).

La catálisis covalente se realiza con una tríada Asp-His-Cys , dividida entre los dos barriles (Asp en β1 e His y Cys en β2). [7] El sustrato se sostiene como una lámina β, formando una interacción antiparalela con la hendidura entre los barriles y una interacción paralela con la cola C-terminal. [8] Por lo tanto, la enzima forma un túnel de unión alrededor del sustrato y las interacciones de la cadena lateral controlan la especificidad. [5]

Especificidad

Modelo de superficie de TEV unido a un sustrato no escindido (negro), que también muestra la tríada catalítica (rojo). El sustrato se une dentro de un túnel del sitio activo (izquierda). Un corte (derecha) muestra la forma complementaria del túnel de unión al sustrato. ( PDB : 1lvb ​)

La secuencia de escisión nativa preferida se identificó primero examinando los sitios de corte en el sustrato de poliproteína nativa para detectar secuencias recurrentes. El consenso para estos sitios de corte nativos es ENLYFQ\S donde '\' denota el enlace peptídico escindido . [4] Los residuos del sustrato están etiquetados de P6 a P1 antes del sitio de corte y P1' después del sitio de corte. Los primeros trabajos también midieron la escisión de una serie de sustratos similares para caracterizar qué tan específica era la proteasa para la secuencia nativa. [9] [10]

Posteriormente, los estudios utilizaron la secuenciación de sustratos escindidos de un conjunto de secuencias aleatorias para determinar patrones de preferencia. [11] [12] Aunque ENLYFQ\S es la secuencia óptima, la proteasa es activa en mayor o menor medida en una variedad de sustratos (es decir, muestra cierta promiscuidad de sustrato ). La escisión más alta es la de las secuencias más cercanas al consenso EXLYΦQ\φ donde X es cualquier residuo, Φ es cualquier hidrófobo grande o mediano y φ es cualquier residuo hidrófobo o polar pequeño. Aunque esta secuencia es la óptima, las secuencias con residuos desfavorecidos en algunas posiciones aún pueden escindirse si el resto de la secuencia es óptima. [10] [12]

La especificidad está dada por la gran área de contacto entre la enzima y el sustrato. Las proteasas como la tripsina tienen especificidad por un residuo antes y después del enlace escindido debido a una hendidura de unión poco profunda con solo una o dos bolsas que unen las cadenas laterales del sustrato. Por el contrario, las proteasas virales como la proteasa TEV tienen una cola C-terminal larga que cubre completamente el sustrato para crear un túnel de unión. Este túnel contiene un conjunto de bolsas de unión estrechas de modo que cada cadena lateral del péptido sustrato (P6 a P1') está unida en un sitio complementario (S6 a S1'). [5]

En particular, la cadena lateral peptídica P6-Glu contacta una red de tres enlaces de hidrógeno; P5-Asn apunta hacia el disolvente, sin realizar interacciones específicas (de ahí la ausencia de consenso de sustrato en esta posición); P4-Leu está enterrado en una bolsa hidrofóbica; P3-Tyr se mantiene en una bolsa hidrófoba con un enlace de hidrógeno corto al final; P2-Phe también está rodeado de hidrófobos, incluida la cara de la tríada histidina; P1-Gln forma cuatro enlaces de hidrógeno; y P1'-Ser está sólo parcialmente encerrado en un surco hidrofóbico poco profundo. [5]

Aplicación como herramienta bioquímica.

Uno de los usos principales de esta proteína es eliminar etiquetas de afinidad de proteínas de fusión recombinantes purificadas . La razón para el uso de la proteasa TEV como herramienta bioquímica es su alta especificidad de secuencia. Esta especificidad permite la escisión controlada de proteínas cuando la secuencia de preferencia se inserta en bucles flexibles. También hace que la proteasa TEV sea relativamente no tóxica in vivo ya que la secuencia reconocida apenas aparece en las proteínas. [13]

Aunque el diseño racional ha tenido un éxito limitado a la hora de cambiar la especificidad de las proteasas, se ha utilizado la evolución dirigida para cambiar el residuo preferido antes [14] o después [15] [16] del sitio de escisión.

Sin embargo, la proteasa TEV tiene limitaciones como herramienta bioquímica. Es propenso a desactivarse por autoescisión (autólisis), aunque esto puede eliminarse mediante una única mutación S219V en el sitio de escisión interna. [17] La ​​proteasa expresada sola también es poco soluble; sin embargo, se han realizado varios intentos para mejorar su solubilidad mediante evolución dirigida y diseño computacional. También se ha demostrado que la expresión puede mejorarse mediante la fusión con la proteína de unión a maltosa (MBP), que actúa como socio potenciador de la solubilidad. [3]

Se ha informado que la proteasa TEV muestra una pérdida de actividad 10 veces mayor a 4 °C. [18] La proteasa TEV muestra pérdida de actividad a temperaturas superiores a 34 °C. [19] La proteasa TEV original requería la presencia de un agente reductor para una alta actividad, lo que podría interferir con la función de las proteínas que contienen enlaces disulfuro. Después de la incorporación de varias mutaciones, las versiones posteriores de "proteasa superTEV" son muy activas en presencia o ausencia de un agente reductor. [20] [21] [22]

El peso molecular de esta enzima varía entre 25 y 27 kDa dependiendo de la construcción específica utilizada.

Referencias

  1. ^ ab UniProt: poliproteína TEV: "P04517".
  2. ^ ab Rawlings ND, Barrett AJ, Bateman A (enero de 2012). "MEROPS: la base de datos de enzimas proteolíticas, sus sustratos e inhibidores". Ácidos nucleicos Res . 40 (Problema de la base de datos): D343–50. doi : 10.1093/nar/gkr987. PMC 3245014 . PMID  22086950. 
  3. ^ ab Kapust RB, Waugh DS (julio de 2000). "Procesamiento intracelular controlado de proteínas de fusión mediante proteasa TEV". Expr. de proteína Purif . 19 (2): 312–8. doi :10.1006/prep.2000.1251. PMID  10873547.
  4. ^ ab Carrington JC, Dougherty WG (mayo de 1988). "Un casete de sitio de escisión viral: identificación de secuencias de aminoácidos necesarias para el procesamiento de poliproteínas del virus del grabado del tabaco". Proc. Nacional. Acad. Ciencia. EE.UU . 85 (10): 3391–5. Código bibliográfico : 1988PNAS...85.3391C. doi : 10.1073/pnas.85.10.3391 . PMC 280215 . PMID  3285343. 
  5. ^ abcd Phan J, Zdanov A, Evdokimov AG, Tropea JE, Peters HK, Kapust RB, Li M, Wlodawer A, Waugh DS (diciembre de 2002). "Base estructural de la especificidad de sustrato de la proteasa del virus del grabado del tabaco". J. Biol. química . 277 (52): 50564–72. doi : 10.1074/jbc.M207224200 . PMID  12377789.
  6. ^ Bazán JF, Fletterick RJ (noviembre de 1988). "Las cisteína proteasas virales son homólogas a la familia de serina proteasas similares a la tripsina: implicaciones estructurales y funcionales". Proc. Nacional. Acad. Ciencia. EE.UU . 85 (21): 7872–6. Código bibliográfico : 1988PNAS...85.7872B. doi : 10.1073/pnas.85.21.7872 . PMC 282299 . PMID  3186696. 
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  8. ^ Tyndall JD, Nall T, Fairlie DP (marzo de 2005). "Las proteasas reconocen universalmente las cadenas beta en sus sitios activos". Química. Rdo . 105 (3): 973–99. doi :10.1021/cr040669e. PMID  15755082.
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