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ARN polimerasa T7

La ARN polimerasa T7 es una ARN polimerasa del bacteriófago T7 que cataliza la formación de ARN a partir de ADN en la dirección 5'→ 3'. [1]

Actividad

La polimerasa T7 es extremadamente específica del promotor y transcribe únicamente el ADN que se encuentra aguas abajo de un promotor T7. [2] La polimerasa T7 también requiere una plantilla de ADN de doble cadena y un ion Mg2 + como cofactor para la síntesis de ARN. Tiene una tasa de error muy baja. La polimerasa T7 tiene un peso molecular de 99 kDa.

Promotor

El promotor es reconocido por su unión e iniciación de la transcripción. El consenso en T7 y fagos relacionados es: [2]

5 pies x 3 piesT7 TAATACGACTCACTATAGGGAGAT3 AATTAACCCTCACTAAAGGGAGAK11 AATTAGGGCACACTATAGGGAGASP6 ATTTACGACACACTATAGAAGAA unir------------ -----------inicio

La transcripción comienza en la guanina marcada con un asterisco. [2]

Estructura

La polimerasa T7 se ha cristalizado en varias formas y las estructuras se han colocado en el PDB . Esto explica cómo la polimerasa T7 se une al ADN y lo transcribe. El dominio N-terminal se mueve a medida que se forma el complejo de elongación. La ssRNAP contiene un híbrido ADN-ARN de 8 pb. [3] Un bucle de especificidad de horquilla beta (residuos 739-770 en T7) reconoce al promotor; al cambiarlo por uno que se encuentra en la RNAP T3, la polimerasa reconoce en su lugar a los promotores T3. [2]

De manera similar a otras polimerasas de ácidos nucleicos virales , incluida la ADN polimerasa T7 del mismo fago, el extremo C-terminal conservado de la ssRNAP T7 emplea un pliegue cuya organización se ha comparado con la forma de una mano derecha con tres subdominios denominados dedos, palma y pulgar. [4] El extremo N-terminal está menos conservado. Forma un dominio de unión al promotor (PBD) con haces de hélices en las ssRNAP del fago, [5] una característica que no se encuentra en las ssRNAP mitocondriales. [6]

Proteínas relacionadas

La polimerasa T7 es un miembro representativo de la familia de las ARN polimerasas dependientes de ADN de subunidad única (ssRNAP). Otros miembros incluyen las ARN polimerasas de fagos T3 y SP6, la ARN polimerasa mitocondrial ( POLRMT ) y la ssRNAP cloroplástica. [7] [8] La familia ssRNAP es estructural y evolutivamente distinta de la familia de múltiples subunidades de las ARN polimerasas (incluidas las subfamilias bacterianas y eucariotas). A diferencia de las ARN polimerasas bacterianas, la polimerasa T7 no es inhibida por el antibiótico rifampicina . Esta familia está relacionada con la transcriptasa inversa de subunidad única y la ADN polimerasa . [9]

Solicitud

En aplicaciones de biotecnología, la ARN polimerasa T7 se utiliza comúnmente para transcribir ADN que ha sido clonado en vectores que tienen dos promotores de fagos (diferentes) (por ejemplo, T7 y T3, o T7 y SP6) en orientación opuesta. El ARN se puede sintetizar selectivamente a partir de cualquiera de las cadenas del ADN insertado con las diferentes polimerasas. La enzima es estimulada por la espermidina y la actividad in vitro aumenta con la presencia de proteínas transportadoras (como BSA ). [10] [11]

Con este sistema se puede generar ARN monocatenario marcado de forma homogénea. Los transcritos se pueden marcar de forma no radiactiva para lograr una alta actividad específica con determinados nucleótidos marcados.

La ARN polimerasa T7 se utiliza en la síntesis de ARNm y ARNsg. [12]

Véase también

Referencias

  1. ^ "T7 RNA Polymerase (20 U/µL)" (ARN polimerasa T7 (20 U/µL)) en www.thermofisher.com . Consultado el 19 de enero de 2023 .
  2. ^ abcd Rong M, He B, McAllister WT, Durbin RK (enero de 1998). "Determinantes de especificidad del promotor de la ARN polimerasa T7". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 95 (2): 515–9. Bibcode :1998PNAS...95..515R. doi : 10.1073/pnas.95.2.515 . PMC 1845 . PMID  9435223. 
  3. ^ Tahirov TH, Temiakov D, Anikin M, Patlan V, McAllister WT, Vassylyev DG, Yokoyama S (noviembre de 2002). "Estructura de un complejo de elongación de la ARN polimerasa T7 a una resolución de 2,9 A". Nature . 420 (6911): 43–50. Bibcode :2002Natur.420...43T. doi :10.1038/nature01129. PMID  12422209. S2CID  4313486.
  4. ^ Hansen JL, Long AM, Schultz SC (agosto de 1997). "Estructura de la ARN polimerasa dependiente de ARN del virus de la poliomielitis". Structure . 5 (8): 1109–22. doi : 10.1016/S0969-2126(97)00261-X . PMID  9309225.
  5. ^ Durniak KJ, Bailey S, Steitz TA (octubre de 2008). "La estructura de una ARN polimerasa T7 transcripcional en transición desde la iniciación hasta la elongación". Science . 322 (5901): 553–7. Bibcode :2008Sci...322..553D. doi :10.1126/science.1163433. PMC 2892258 . PMID  18948533. 
  6. ^ Hillen HS, Morozov YI, Sarfallah A, Temiakov D, Cramer P (noviembre de 2017). "Base estructural de la iniciación de la transcripción mitocondrial". Cell . 171 (5): 1072–1081.e10. doi :10.1016/j.cell.2017.10.036. PMC 6590061 . PMID  29149603. 
  7. ^ McAllister WT, Raskin CA (octubre de 1993). "Las ARN polimerasas de los fagos están relacionadas con las ADN polimerasas y las transcriptasas inversas". Microbiología molecular . 10 (1): 1–6. doi :10.1111/j.1365-2958.1993.tb00897.x. PMID  7526118. S2CID  19322112.
  8. ^ Hedtke B, Börner T, Weihe A (agosto de 1997). "ARN polimerasas de tipo fago mitocondrial y cloroplasto en Arabidopsis". Ciencia . 277 (5327): 809–11. doi : 10.1126/ciencia.277.5327.809. PMID  9242608.
  9. ^ Cermakian N, Ikeda TM, Miramontes P, Lang BF, Gray MW, Cedergren R (diciembre de 1997). "Sobre la evolución de las ARN polimerasas de una sola subunidad". Revista de evolución molecular . 45 (6): 671–81. Código Bib : 1997JMolE..45..671C. CiteSeerX 10.1.1.520.3555 . doi :10.1007/PL00006271. PMID  9419244. S2CID  1624391. 
  10. ^ Chamberlin M, Ring J (marzo de 1973). "Caracterización de la polimerasa de ácido ribonucleico específica de T7. 1. Propiedades generales de la reacción enzimática y especificidad de la plantilla de la enzima". The Journal of Biological Chemistry . 248 (6): 2235–44. doi : 10.1016/S0021-9258(19)44211-7 . PMID  4570474.
  11. ^ Maslak M, Martin CT (junio de 1994). "Efectos de las condiciones de la solución en la cinética de estado estable de la iniciación de la transcripción por la ARN polimerasa T7". Bioquímica . 33 (22): 6918–24. doi :10.1021/bi00188a022. PMID  7911327.
  12. ^ "T7 RNA Polymerase | NEB" (ARN polimerasa T7 | NEB) www.neb.com . Consultado el 19 de enero de 2023 .

Lectura adicional

Enlaces externos