Un cebador es un ácido nucleico corto de una sola hebra utilizado por todos los organismos vivos en el inicio de la síntesis de ADN . Un cebador sintético también puede denominarse oligo , abreviatura de oligonucleótido. Las enzimas de la ADN polimerasa (responsable de la replicación del ADN) solo son capaces de agregar nucleótidos al extremo 3' de un ácido nucleico existente, lo que requiere que un cebador se una a la plantilla antes de que la ADN polimerasa pueda comenzar una cadena complementaria. [1] La ADN polimerasa agrega nucleótidos después de unirse al cebador de ARN y sintetiza toda la cadena. Más tarde, las cadenas de ARN deben eliminarse con precisión y reemplazarlas con nucleótidos de ADN formando una región de espacio conocida como mella que se rellena utilizando una enzima llamada ligasa. [2] El proceso de eliminación del cebador de ARN requiere varias enzimas, como Fen1, Lig1 y otras que trabajan en coordinación con la ADN polimerasa, para asegurar la eliminación de los nucleótidos de ARN y la adición de nucleótidos de ADN. Los organismos vivos utilizan únicamente cebadores de ARN, mientras que las técnicas de laboratorio en bioquímica y biología molecular que requieren la síntesis de ADN in vitro (como la secuenciación de ADN y la reacción en cadena de la polimerasa ) suelen utilizar cebadores de ADN, ya que son más estables a la temperatura. Los cebadores se pueden diseñar en el laboratorio para reacciones específicas, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Al diseñar cebadores de PCR, hay medidas específicas que se deben tener en cuenta, como la temperatura de fusión de los cebadores y la temperatura de hibridación de la propia reacción. Además, la secuencia de unión al ADN del cebador in vitro debe elegirse específicamente, lo que se hace utilizando un método llamado herramienta de búsqueda de alineamiento local básico (BLAST) que escanea el ADN y encuentra regiones específicas y únicas para que se una el cebador.
Los organismos vivos utilizan cebadores de ARN para iniciar la síntesis de una cadena de ADN . Una clase de enzimas llamadas primasas añaden un cebador de ARN complementario a la plantilla de lectura de novo tanto en la cadena principal como en la rezagada . A partir del 3'-OH libre del cebador, conocido como el extremo del cebador, una ADN polimerasa puede extender una cadena recién sintetizada. La cadena principal en la replicación del ADN se sintetiza en una pieza continua que se mueve con la horquilla de replicación , requiriendo solo un cebador de ARN inicial para comenzar la síntesis. En la cadena rezagada, el ADN plantilla corre en la dirección 5'→3' . Dado que la ADN polimerasa no puede agregar bases en la dirección 3 '→5' complementaria a la cadena plantilla, el ADN se sintetiza "hacia atrás" en fragmentos cortos que se alejan de la horquilla de replicación, conocidos como fragmentos de Okazaki . A diferencia de la cadena principal, este método da como resultado el inicio y la detención repetidos de la síntesis de ADN, lo que requiere múltiples cebadores de ARN. A lo largo de la plantilla de ADN, la primasa intercala cebadores de ARN que la ADN polimerasa utiliza para sintetizar ADN en la dirección 5′→3′. [1]
Otro ejemplo de iniciadores que se utilizan para permitir la síntesis de ADN es la transcripción inversa . La transcriptasa inversa es una enzima que utiliza una cadena de ARN molde para sintetizar una cadena complementaria de ADN. El componente ADN polimerasa de la transcriptasa inversa requiere un extremo 3' existente para comenzar la síntesis. [1]
Después de la inserción de los fragmentos de Okazaki , se eliminan los cebadores de ARN (el mecanismo de eliminación difiere entre procariotas y eucariotas ) y se reemplazan con nuevos desoxirribonucleótidos que llenan los espacios donde estaba presente el cebador de ARN. Luego, la ADN ligasa une las hebras fragmentadas, completando la síntesis de la hebra rezagada. [1]
En procariotas, la ADN polimerasa I sintetiza el fragmento de Okazaki hasta que alcanza el cebador de ARN anterior. Luego, la enzima actúa simultáneamente como una exonucleasa 5′→3′ , eliminando los ribonucleótidos del cebador por delante y añadiendo desoxirribonucleótidos por detrás. Tanto las actividades de polimerización como de escisión del cebador de ARN ocurren en la dirección 5′→3′ , y la polimerasa I puede realizar estas actividades simultáneamente; esto se conoce como “Nick Translation”. [3] La traducción de nick se refiere a la actividad sincronizada de la polimerasa I al eliminar el cebador de ARN y agregar desoxirribonucleótidos . Más tarde, se forma un espacio entre las hebras llamado nick, que se sella utilizando una ADN ligasa .
En eucariotas, la eliminación de cebadores de ARN en la hebra rezagada es esencial para la finalización de la replicación. Por lo tanto, a medida que la hebra rezagada se sintetiza por la ADN polimerasa δ en la dirección 5' → 3' , se forman fragmentos de Okazaki , que son hebras discontinuas de ADN. Luego, cuando la ADN polimerasa llega al extremo 5' del cebador de ARN desde el fragmento de Okazaki anterior, desplaza el extremo 5' del cebador en un colgajo de ARN monocatenario que se elimina por escisión de nucleasa. La escisión de los colgajos de ARN implica tres métodos de eliminación de cebadores. [4] La primera posibilidad de eliminación de cebadores es mediante la creación de un colgajo corto que se elimina directamente por la endonucleasa 1 específica de la estructura del colgajo (FEN-1), que escinde el colgajo sobresaliente 5'. Este método se conoce como la vía del colgajo corto de eliminación de cebadores de ARN. [5] La segunda forma de escindir un cebador de ARN es degradando la cadena de ARN utilizando una ARNasa , en eucariotas se conoce como ARNasa H2. Esta enzima degrada la mayor parte del cebador de ARN hibridado, excepto los nucleótidos cercanos al extremo 5' del cebador. Por lo tanto, los nucleótidos restantes se muestran en una solapa que se escinde utilizando FEN-1. El último método posible para eliminar el cebador de ARN se conoce como la vía de la solapa larga. [5] En esta vía, se reclutan varias enzimas para alargar el cebador de ARN y luego escindirlo. Las solapas se alargan mediante una helicasa de 5' a 3' , conocida como Pif1 . Después de la adición de nucleótidos a la solapa por Pif1, la proteína de replicación A (RPA) estabiliza la solapa larga . El ADN unido a RPA inhibe la actividad o el reclutamiento de FEN1, como resultado, se debe reclutar otra nucleasa para escindir el colgajo. [4] Esta segunda nucleasa es la nucleasa DNA2 , que tiene una actividad de helicasa-nucleasa, que escinde el colgajo largo del cebador de ARN, que luego deja atrás un par de nucleótidos que son escindidos por FEN1. Al final, cuando se han eliminado todos los cebadores de ARN, se forman mellas entre los fragmentos de Okazaki que se rellenan con desoxirribonucleótidos utilizando una enzima conocida como ligasa1 , a través de un proceso llamado ligación .
Los cebadores sintéticos, a veces conocidos como oligos, son oligonucleótidos sintetizados químicamente , generalmente de ADN, que se pueden personalizar para que se asocien a un sitio específico en el ADN molde. En solución, el cebador se hibrida espontáneamente con el molde a través del apareamiento de bases Watson-Crick antes de ser extendido por la ADN polimerasa. La capacidad de crear y personalizar cebadores sintéticos ha demostrado ser una herramienta invaluable necesaria para una variedad de enfoques biológicos moleculares que involucran el análisis de ADN. Tanto el método de terminación de cadena de Sanger como el método " Next-Gen " de secuenciación de ADN requieren cebadores para iniciar la reacción. [1]
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utiliza un par de cebadores personalizados para dirigir la elongación del ADN hacia cada uno de los extremos opuestos de la secuencia que se está amplificando. Estos cebadores tienen normalmente entre 18 y 24 bases de longitud y deben codificar únicamente los sitios específicos de la secuencia que se está amplificando. Un cebador que pueda unirse a múltiples regiones a lo largo del ADN las amplificará todas, eliminando así el propósito de la PCR. [1]
Se deben tener en cuenta algunos criterios al diseñar un par de cebadores para PCR. Los pares de cebadores deben tener temperaturas de fusión similares, ya que la hibridación durante la PCR se produce para ambas cadenas simultáneamente, y esta temperatura de fusión compartida no debe ser ni demasiado superior ni inferior a la temperatura de hibridación de la reacción . Un cebador con una Tm (temperatura de fusión) demasiado superior a la temperatura de hibridación de la reacción puede hibridarse incorrectamente y extenderse en una ubicación incorrecta a lo largo de la secuencia de ADN. Una Tm significativamente inferior a la temperatura de hibridación puede no hibridarse ni extenderse en absoluto.
Además, las secuencias de cebadores deben elegirse para seleccionar de forma única una región de ADN, evitando la posibilidad de hibridación con una secuencia similar cercana. Un método comúnmente utilizado para seleccionar un sitio de cebador es la búsqueda BLAST , mediante la cual se pueden ver todas las regiones posibles a las que se puede unir un cebador. Tanto la secuencia de nucleótidos como el propio cebador se pueden buscar con BLAST. La herramienta gratuita NCBI Primer-BLAST integra el diseño de cebadores y la búsqueda BLAST en una sola aplicación, [6] al igual que los productos de software comerciales como ePrime y Beacon Designer . Se pueden realizar simulaciones por computadora de resultados teóricos de PCR ( PCR electrónica ) para ayudar en el diseño de cebadores proporcionando temperaturas de fusión y recocido, etc. [7]
A partir de 2014, existen muchas herramientas en línea disponibles de forma gratuita para el diseño de cebadores, algunas de las cuales se centran en aplicaciones específicas de la PCR. Se pueden diseñar cebadores con alta especificidad para un subconjunto de plantillas de ADN en presencia de muchas variantes similares mediante algún software (por ejemplo, DECIPHER [8] ) o se pueden desarrollar de forma independiente para un grupo específico de animales. [9]
La selección de una región específica de ADN para la unión de cebadores requiere algunas consideraciones adicionales. Se deben evitar las regiones con un alto contenido de repeticiones de mononucleótidos y dinucleótidos, ya que se puede producir la formación de bucles y contribuir a la hibridación incorrecta. Los cebadores no deben anexarse fácilmente con otros cebadores de la mezcla; este fenómeno puede conducir a la producción de productos de "dímero de cebadores" que contaminen la solución final. Los cebadores tampoco deben anexarse fuertemente a sí mismos, ya que las horquillas y bucles internos podrían obstaculizar la anexión con el ADN molde.
Al diseñar cebadores, se pueden agregar bases de nucleótidos adicionales a los extremos posteriores de cada cebador, lo que da como resultado una secuencia de capuchón personalizada en cada extremo de la región amplificada. Una aplicación de esta práctica es su uso en la clonación TA , una técnica de subclonación especial similar a la PCR, donde se puede aumentar la eficiencia agregando colas AG a los extremos 5′ y 3′. [10]
Algunas situaciones pueden requerir el uso de cebadores degenerados. Se trata de mezclas de cebadores que son similares, pero no idénticos. Estos pueden ser convenientes cuando se amplifica el mismo gen de diferentes organismos , ya que las secuencias son probablemente similares pero no idénticas. Esta técnica es útil porque el código genético en sí es degenerado , lo que significa que varios codones diferentes pueden codificar el mismo aminoácido . Esto permite que diferentes organismos tengan una secuencia genética significativamente diferente que codifique una proteína muy similar. Por esta razón, los cebadores degenerados también se utilizan cuando el diseño de cebadores se basa en la secuencia de proteínas , ya que no se conoce la secuencia específica de codones. Por lo tanto, la secuencia del cebador correspondiente al aminoácido isoleucina podría ser "ATH", donde A representa adenina , T a timina y H adenina , timina o citosina , según el código genético de cada codón , utilizando los símbolos IUPAC para bases degeneradas . Es posible que los cebadores degenerados no se hibriden perfectamente con una secuencia objetivo, lo que puede reducir en gran medida la especificidad de la amplificación por PCR.
Los cebadores degenerados se utilizan ampliamente y son extremadamente útiles en el campo de la ecología microbiana . Permiten la amplificación de genes de microorganismos no cultivados hasta el momento o permiten la recuperación de genes de organismos donde no se dispone de información genómica. Por lo general, los cebadores degenerados se diseñan alineando la secuenciación de genes que se encuentra en GenBank . Las diferencias entre secuencias se explican utilizando degeneraciones IUPAC para bases individuales. Luego, los cebadores de PCR se sintetizan como una mezcla de cebadores correspondientes a todas las permutaciones de la secuencia de codones.
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