Un complejo de prerreplicación ( pre-RC ) es un complejo proteico que se forma en el origen de la replicación durante el paso de iniciación de la replicación del ADN . La formación del pre-RC es necesaria para que se produzca la replicación del ADN. La replicación completa y fiel del genoma garantiza que cada célula hija llevará la misma información genética que la célula madre. En consecuencia, la formación del pre-RC es una parte muy importante del ciclo celular .
A medida que los organismos evolucionaron y se volvieron cada vez más complejos, también lo hicieron sus pre-RC. A continuación, se presenta un resumen de los componentes de los pre-RC en los diferentes dominios de la vida.
En las bacterias , el componente principal del pre-RC es DnaA . El pre-RC está completo cuando DnaA ocupa todos sus sitios de unión dentro del origen de replicación bacteriano ( oriC ). Los sitios particulares en el oriC a los que se une DnaA determinan si la célula tiene un bORC (complejo de reconocimiento del origen bacteriano) o un pre-RC. [1]
El pre-RC arqueal es muy diferente del pre-RC bacteriano y puede servir como un modelo simplificado del pre-RC eucariota. Está compuesto por una proteína de complejo de reconocimiento de origen único (ORC), Cdc6 / ORC1 , y un homohexámero de la proteína de mantenimiento de minicromosomas (MCM). Sulfolobus islandicus también utiliza un homólogo de Cdt1 para reconocer uno de sus orígenes de replicación. [2]
El pre-RC eucariota es el pre-RC más complejo y altamente regulado. En la mayoría de los eucariotas está compuesto por seis proteínas ORC (ORC1-6), Cdc6 , Cdt1 y un heterohexámero de las seis proteínas MCM (MCM2-7). El heterohexámero MCM surgió posiblemente a través de eventos de duplicación del gen MCM y la posterior evolución divergente. El pre-RC de Schizosaccharomyces pombe ( S. pombe ) es notablemente diferente al de otros eucariotas; Cdc6 es reemplazado por la proteína homóloga Cdc18. Sap1 también está incluido en el pre-RC de S. pombe porque es necesario para la unión de Cdc18. El pre-RC de Xenopus laevis ( X. laevis ) también tiene una proteína adicional, MCM9, que ayuda a cargar el heterohexámero MCM en el origen de replicación. [3] Se ha resuelto la estructura del ORC, MCM, así como del complejo intermedio ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7 (OCCM). [4]
El reconocimiento del origen de la replicación es un primer paso fundamental en la formación del pre-RC. En diferentes dominios de la vida, este proceso se lleva a cabo de manera diferente.
En los procariotas, el reconocimiento del origen se lleva a cabo por DnaA. DnaA se une firmemente a una secuencia de consenso de 9 pares de bases en oriC; 5' – TTATCCACA – 3'. Hay 5 de estas secuencias de 9 pb (R1-R5) y 4 secuencias no consenso (I1-I4) dentro de oriC a las que DnaA se une con afinidad diferencial. DnaA se une a R4, R1 y R2 con alta afinidad y a R5, I1, I2, I3 y R3 con menor afinidad. [5] In vivo, se ha observado que la unión de DnaA a los sitios de reconocimiento ocurre en el orden: R1, R2, luego R4, que forma el bORC. Después, los otros sitios de reconocimiento de 9 pb de menor afinidad se unen a DnaA, que forma el pre-RC. [6]
Las arqueas tienen entre 1 y 3 orígenes de replicación. Los orígenes son generalmente tractos ricos en AT que varían según la especie de arquea. La proteína ORC arqueal singular reconoce los tractos ricos en AT y se une al ADN de una manera dependiente del ATP.
Los eucariotas suelen tener múltiples orígenes de replicación; al menos uno por cromosoma. Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) es el único eucariota conocido con una secuencia de iniciación definida TTTTTATG/ATTTA/T. [7] Esta secuencia de iniciación es reconocida por ORC1-5. No se sabe que ORC6 se una al ADN en S. cerevisiae . Las secuencias de iniciación en S. pombe y eucariotas superiores no están bien definidas. Sin embargo, las secuencias de iniciación generalmente son ricas en AT o exhiben una topología de ADN doblada o curvada. Se sabe que la proteína ORC4 se une a la porción rica en AT del origen de replicación en S. pombe usando motivos de gancho AT . El mecanismo de reconocimiento del origen en eucariotas superiores no se entiende bien, pero se cree que las proteínas ORC1-6 dependen de una topología de ADN inusual para la unión. [8]
El ensamblaje del complejo de prerreplicación solo ocurre durante la fase M tardía y la fase G1 temprana del ciclo celular, cuando la actividad de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) es baja. Este momento y otros mecanismos reguladores garantizan que la replicación del ADN solo se produzca una vez por ciclo celular. El ensamblaje del complejo prerreplicativo depende del reconocimiento previo del origen, ya sea por DnaA en procariotas o por ORC en arqueas y eucariotas.
El pre-RC de los procariotas se completa cuando DnaA ocupa todos los sitios de unión posibles dentro del oriC. DnaA solo puede unirse a los sitios de baja afinidad en el oriC una vez que la proteína fis se elimina del oriC. Al eliminar fis, la proteína IHF (factor huésped integrado) se une a un sitio entre R1 y R2, lo que permite que DnaA se una a los sitios de baja afinidad en el oriC. Esto completa el pre-RC. [9]
El pre-RC de las arqueas requiere la unión del ORC del origen. Después de esto, Cdc6 y el complejo homohexamérico MCM se unen de manera secuencial.
Los eucariotas tienen el pre-RC más complejo. Después de que ORC1-6 se une al origen de replicación, se recluta a Cdc6. Cdc6 recluta al factor de licencia Cdt1 y MCM2-7. La unión de Cdt1 y la hidrólisis de ATP por ORC y Cdc6 cargan MCM2-7 en el ADN. Hay un exceso estequiométrico de las proteínas MCM sobre las proteínas ORC y Cdc6, lo que indica que puede haber múltiples heterohexámeros MCM unidos a cada origen de replicación. [3]
Una vez formado el pre-RC, debe activarse y ensamblarse el replisoma para que se produzca la replicación del ADN.
En los procariotas, la DnaA hidroliza el ATP para desenrollar el ADN en el oriC. Esta región desnaturalizada es accesible a la helicasa DnaB y al cargador de la helicasa DnaC . Las proteínas de unión de cadena sencilla estabilizan la burbuja de replicación recién formada e interactúan con la primasa DnaG . La DnaG recluta a la ADN polimerasa III replicativa y comienza la replicación.
En eucariotas, el heterohexámero MCM es fosforilado por CDC7 y CDK, que desplaza a Cdc6 y recluta a MCM10 . MCM10 coopera con MCM2-7 en el reclutamiento de Cdc45 . Cdc45 luego recluta componentes clave del replisoma ; la ADN polimerasa replicativa α y su primasa. La replicación del ADN puede entonces comenzar. [10]
Durante cada ciclo celular, es importante que el genoma se replique completamente una sola vez. La formación del complejo de prerreplicación durante la fase M tardía y la fase G1 temprana es necesaria para la replicación del genoma, pero una vez que el genoma se ha replicado, el complejo de prerreplicación no debe formarse nuevamente hasta el siguiente ciclo celular.
En procariotas, varios estudios han demostrado que el pre-RC es un complejo que solo está presente durante una fracción del ciclo celular. Una vez que ocurre una división celular, el pre-RC debe revertirse a bORC para garantizar que solo ocurra una ronda de replicación de ADN durante la división. En E. coli , hay 11 sitios GATC en el oriC que experimentan hemimetilación durante la replicación de ADN. La proteína SeqA se une a estos sitios evitando la remetilación y bloqueando la unión de DnaA a sitios de baja afinidad durante aproximadamente un tercio del ciclo celular. Sin embargo, SeqA no bloquea la unión de DnaA a los sitios R1, R2 y R4. Por lo tanto, el bORC se restablece y está preparado para sufrir otra conversión a pre-RC. [11]
En S. cerevisiae, las CDK previenen la formación del complejo de replicación durante las últimas fases G1, S y G2 al excluir MCM2-7 y Cdt1 del núcleo, dirigir Cdc6 para su degradación por el proteasoma y disociar ORC1-6 de la cromatina mediante fosforilación . [12] La prevención de la re-replicación en S. pombe es ligeramente diferente; Cdt1 es degradado por el proteasoma en lugar de simplemente ser excluido del núcleo. [13] La regulación proteolítica de Cdt1 es compartida por eucariotas superiores, incluidos Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster , X. laevis y mamíferos . Los metazoos tienen un cuarto mecanismo para prevenir la re-replicación ; durante S y G2, la geminina se une a Cdt1 e inhibe que Cdt1 cargue MCM2-7 en el origen de replicación. [8]
Se sabe que los defectos en los componentes del complejo de replicación eucariota causan el síndrome de Meier-Gorlin, que se caracteriza por enanismo , rótulas ausentes o hipoplásicas , orejas pequeñas, deterioro del crecimiento pre y posnatal y microcefalia . [14] [15] Las mutaciones conocidas están en los genes ORC1 , ORC4 , ORC6 , CDT1 y CDC6 . [15] El fenotipo de la enfermedad probablemente se origina por la capacidad reducida de las células para proliferar , lo que lleva a un número de células y un fracaso general del crecimiento. [16 ]