(p)ppGpp , pentafosfato y tetrafosfato de guanosina , también conocidos como nucleótidos del "punto mágico" , [1] son alarmones implicados en la respuesta estricta en bacterias que causan la inhibición de la síntesis de ARN cuando hay escasez de aminoácidos . Esta inhibición por (p)ppGpp disminuye la traducción en la célula, conservando los aminoácidos presentes. Además, ppGpp y pppGpp causan la regulación positiva de muchos otros genes implicados en la respuesta al estrés, como los genes para la absorción de aminoácidos (del medio circundante ) y la biosíntesis . [2] (p)ppGpp también se conserva en plantas , donde se sabe que desempeña un papel en la regulación de los procesos de crecimiento y desarrollo. [3]
ppGpp y pppGpp fueron identificados por primera vez por Michael Cashel en 1969. [4] Se descubrió que estos nucleótidos se acumulaban rápidamente en células de Escherichia coli privadas de aminoácidos e inhibían la síntesis de ARN ribosómico y de transferencia. [5] Ahora se sabe que (p)ppGpp también se produce en respuesta a otros factores estresantes, incluida la falta de carbono y fosfato. Históricamente, la literatura que rodea a (p)ppGpp ha proporcionado hallazgos e información contradictorios sobre su papel en las respuestas al estrés bacteriano. [6]
Se ha demostrado que E. coli es más sensible a las acumulaciones de tetrafosfato de guanosina que de pentafosfato de guanosina. [7] Una ausencia completa de (p)ppGpp provoca múltiples requerimientos de aminoácidos, poca supervivencia de cultivos envejecidos, división celular aberrante, morfología e inmotilidad, además de quedar bloqueado en un modo de crecimiento durante la entrada en inanición.
La síntesis y degradación de (p)ppGpp se han caracterizado más ampliamente en el organismo modelo bacteriano Escherichia coli.
La pppGpp se crea a través de la pppGpp sintasa , también conocida como RelA, y se convierte de pppGpp a ppGpp a través de la pppGpp fosfohidrolasa. La RelA está asociada con aproximadamente uno de cada doscientos ribosomas y se activa cuando una molécula de ARN de transferencia (ARNt) sin carga ingresa al sitio A del ribosoma, debido a la escasez de aminoácidos requeridos por el ARNt. Si una bacteria mutante es relA , se dice que está relajada y no se observa ninguna regulación de la producción de ARN debido a la ausencia de aminoácidos.
E. coli produce una segunda proteína responsable de la degradación de (p)ppGpp, SpoT . Cuando se restablece el equilibrio de aminoácidos en la célula, (p)ppGpp es hidrolizada por SpoT y regresa a un estado energéticamente más favorable. Esta proteína también tiene la capacidad de sintetizar (p)ppGpp y parece ser la sintasa primaria en ciertas condiciones de estrés. La mayoría de las demás bacterias codifican una sola proteína que es responsable tanto de la síntesis como de la degradación de (p)ppGpp, generalmente homólogas de SpoT.
Los objetivos de (p)ppGpp incluyen operones de ARNr , de los cuales hay siete en E. coli , todos los cuales tienen 2 promotores . Cuando (p)ppGpp se asocia con el promotor, afecta la capacidad de la enzima ARN polimerasa para unirse e iniciar la transcripción . Se cree que (p)ppGpp puede afectar la estabilidad del complejo abierto formado por la ARN polimerasa en el ADN y, por lo tanto, afectar la eliminación del promotor. Su presencia también conduce a un aumento de la pausa durante la elongación de la transcripción y compite con los sustratos de trifosfato de nucleósido .
Actualmente existe consenso en que (p)ppGpp es un determinante del control de la tasa de crecimiento más que las concentraciones del sustrato trifosfato de nucleósido (NTP).
ppGpp inhibe la formación del dipéptido de iniciación fMet-Phe mediada por IF2, probablemente al interferir con las interacciones de las subunidades 30S y 50S. E. coli acumula más ppGpp que pppGpp durante la carencia de aminoácidos, y ppGpp tiene una eficiencia aproximadamente 8 veces mayor que la de pppGpp. Mientras que B. subtilis acumula más pppGpp que ppGpp.
En E. coli, la falta de aminoácidos inhibió la replicación del ADN en la etapa de iniciación en oriC, probablemente debido a la falta de la proteína de iniciación de la replicación DnaA. En B. subtilis, la detención de la replicación debido a la acumulación de (p)ppGpp es causada por la unión de una proteína Rtp a sitios específicos a unos 100-200 kb de distancia de oriC en ambas direcciones. La (p)ppGpp inhibió directamente la ADN primasa (DnaG). A diferencia de E. coli, B. subtilis acumula más pppGpp que ppGpp; el nucleótido más abundante es un inhibidor más potente de DnaG. ppGpp puede unirse con la proteína Obg, que pertenece a la familia de proteínas GTPasas pequeñas conservadas. La proteína Obg interactúa con varios reguladores (RsbT, RsbW, RsbX) necesarios para la activación por estrés de sigma B.
Los niveles de (p)ppGpp del huésped parecen actuar como un sensor para el desarrollo del fago lambda, afectando principalmente la transcripción. Los niveles modestos de ppGpp inhiben pR y los promotores activos pE, pI y paQ in vivo y tienen efectos in vitro que parecen favorecer la lisogenia. Por el contrario, las concentraciones ausentes o altas de (p)ppGpp favorecen la lisis. Los niveles modestos de ppGpp favorecen la lisogenia al conducir a niveles bajos de HflB (FtsH). Cuando ppGpp está ausente o alto, los niveles de proteasa HflB son altos; esto conduce a niveles más bajos de CII (una proteína del fago que promueve la lisogenia) y favorece la lisis.
Uno de los elementos clave de los promotores inhibidos por (p)ppGpp es la presencia de un discriminador rico en GC, definido como una región entre la caja TATA (caja -10) y +1 nt (donde +1 es el sitio de inicio de la transcripción). Los promotores regulados negativamente por ppGpp tienen un enlazador de 16 pb, en contraste con el consenso de 17 pb. Los promotores activados por ppGpp parecen tener un discriminador rico en AT y enlazadores persistentes (por ejemplo, el enlazador del promotor his es de 18 pb).
La evidencia genética que sugiere que la ARN polimerasa era el objetivo de la ppGpp surgió del descubrimiento de que los mutantes M+ (también llamados mutantes ARN polimerasa estrictos) muestran una imitación in vitro e in vivo de la fisiología y la regulación de la transcripción conferidas por (p)ppGpp, incluso en su ausencia. La reticulación de ppGpp con ARN polimerasa reforzó esta noción. Los detalles estructurales de una asociación entre ppGpp y ARN polimerasa surgieron del análisis de cocristales que posicionaron a ppGpp en el canal secundario de ARN polimerasa cerca del centro catalítico.
DksA es una proteína de 17 kDa, su estructura es similar a GreA y GreB, que son factores de elongación transcripcional bien caracterizados . GreA y GreB se unen directamente a la ARN polimerasa en lugar de al ADN y actúan insertando su dominio de dedo enrollado N-terminal a través del canal secundario de la ARN polimerasa. Dos residuos ácidos conservados en la punta del dominio de dedo son necesarios para inducir la capacidad intrínseca de la ARN polimerasa de escindir el ARN retrocedido. DksA también posee dos residuos ácidos en la punta de su dedo, pero no induce actividad de escisión nucleolítica. En cambio, se propone que estos residuos estabilizan la unión de ppGpp a la ARN polimerasa mediante la coordinación mutua de un ion Mg2+ que es crucial para la polimerización.
ppGpp inhibe directamente la transcripción de los promotores ribosómicos. Un modelo es el de ppGpp y DksA juntos e independientemente disminuyen la estabilidad de los complejos abiertos formados en el ADN por la ARN polimerasa. Otro modelo es el mecanismo de atrapamiento. En este modelo, la ARN polimerasa es atrapada por ppGpp en complejos cerrados y es incapaz de iniciar la transcripción. Por lo tanto, ppGpp parece actuar en muchos niveles, y el mecanismo de su acción es un resultado complejo de varios factores, entre los que las propiedades intrínsecas del promotor no son el menor de ellos. La activación de la transcripción por ppGpp puede ser directa o indirecta. La activación directa ocurre cuando la ARN polimerasa interactúa con efectores, como ppGpp, DksA o ambos, para aumentar la transcripción de un promotor determinado. La activación indirecta por estos efectores de un promotor depende de la inhibición de otros promotores (fuertes), lo que conduce a una mayor disponibilidad de la ARN polimerasa que activa indirectamente el inicio de la transcripción. Los promotores que se activan directamente por ppGpp incluyen P argI , P thrABC , P livJ y P hisG . Los promotores de activación indirecta incluyen estos dependientes de factores sigma: S, H, N, E. Cuando se inhiben promotores fuertes, como rrn , hay más ARN polimerasa disponible para estos factores sigma alternativos.
Cuando (p)ppGpp está ausente, la patogenicidad se ve comprometida por razones que varían según el organismo estudiado. La eliminación de los genes rel A y spo T, pero no rel A solo, dio un estado (p)ppGpp 0 que resultó en una fuerte atenuación en ratones y no invasividad in vitro. Las pruebas de vacunas revelan que 30 días después de la inmunización única con la cepa (p)ppGpp 0 , los ratones estaban protegidos del desafío con Salmonella de tipo salvaje a una dosis 10 6 -veces por encima de la LD 50 establecida .
Se ha propuesto que el aumento de la síntesis de (p)ppGpp causaría la acumulación de polifosfato (PolyP) en E. coli . [8] La alarmona podría interactuar con la exopolifosfatasa PPX , que inhibiría la hidrólisis de PolyP, provocando así su acumulación en las bacterias. Aunque recientemente se ha demostrado que en realidad es DksA y no (p)ppGpp la que causa esta acumulación. [9] Se ha demostrado en Pseudomonas aeruginosa que el mutante phoU ( phoU pertenece al Regulón Pho ) sintetiza más (p)ppGpp y esta sería una de las razones por las que acumula más polifosfato. [10]