La cromatografía de capa fina ( TLC ) es una técnica cromatográfica que separa los componentes en mezclas no volátiles. [1]
Se realiza en una placa de TLC formada por un sólido no reactivo recubierto con una fina capa de material adsorbente . [2] Esto se llama fase estacionaria. [2] La muestra se deposita en la placa, que se eluye con un disolvente o mezcla de disolventes conocida como fase móvil (o eluyente ). [3] Este disolvente luego sube por la placa mediante acción capilar . [4] Como ocurre con toda la cromatografía , algunos compuestos son más atraídos por la fase móvil, mientras que otros son más atraídos por la fase estacionaria. [5] Por lo tanto, diferentes compuestos se mueven por la placa de TLC a diferentes velocidades y se separan. [6] Para visualizar compuestos incoloros, la placa se observa bajo luz ultravioleta o se tiñe. [7] A menudo es necesario probar diferentes fases estacionarias y móviles para obtener puntos bien definidos y separados. [ cita requerida ]
La TLC es rápida, sencilla y ofrece una alta sensibilidad a un coste relativamente bajo. [5] Puede supervisar el progreso de una reacción, identificar compuestos en una mezcla, determinar la pureza o purificar pequeñas cantidades de un compuesto. [5]
El proceso de cromatografía en capa fina es similar a la cromatografía en papel , pero permite realizar operaciones más rápidas, mejores separaciones y elegir entre diferentes fases estacionarias. [5] Las placas se pueden etiquetar antes o después del proceso de cromatografía con un lápiz u otro instrumento que no interfiera con el proceso. [8]
Hay cuatro etapas principales para ejecutar una placa de cromatografía de capa fina: [3] [8]
Preparación de la placa: con un tubo capilar, se deposita una pequeña cantidad de una solución concentrada de la muestra cerca del borde inferior de una placa de TLC. Se deja que el disolvente se evapore por completo antes del siguiente paso. Puede ser necesaria una cámara de vacío para disolventes no volátiles. Para asegurarse de que haya suficiente compuesto para obtener un resultado visible, se puede repetir el procedimiento de detección. Según la aplicación, se pueden colocar varias muestras diferentes en una fila a la misma distancia del borde inferior; cada muestra se moverá hacia arriba en la placa en su propio "carril".
Preparación de la cámara de revelado: El disolvente o la mezcla de disolventes se coloca en un recipiente transparente (cámara de separación/revelado) a una profundidad de menos de 1 centímetro. También se coloca una tira de papel de filtro (también conocida como "mecha") a lo largo de la pared del recipiente. Este papel de filtro debe tocar el disolvente y casi llegar a la parte superior del recipiente. El recipiente se cubre con una tapa y se permite que los vapores del disolvente saturen la atmósfera del recipiente. De lo contrario, la separación será deficiente y los resultados no serán reproducibles.
Desarrollo: La placa de TLC se coloca en el recipiente de manera que el punto o puntos de muestra no queden sumergidos en la fase móvil. El recipiente se cubre para evitar la evaporación del disolvente. El disolvente migra hacia arriba por la placa por acción capilar , se encuentra con la mezcla de muestra y la lleva hacia arriba por la placa (eluye la muestra). La placa se retira del recipiente antes de que el disolvente alcance la parte superior de la placa; de lo contrario, los resultados serán engañosos. Se marca el frente del disolvente , la marca más alta que el disolvente ha recorrido a lo largo de la placa.
Visualización: el solvente se evapora de la placa. Los métodos de visualización incluyen luz ultravioleta, tinción y muchos más.
La separación de compuestos se debe a las diferencias en su atracción hacia la fase estacionaria y a las diferencias en la solubilidad en el disolvente. [9] Como resultado, los compuestos y la fase móvil compiten por los sitios de unión en la fase estacionaria. [9] Los diferentes compuestos en la mezcla de muestra viajan a diferentes velocidades debido a las diferencias en sus coeficientes de partición . [10] Los diferentes disolventes, o diferentes mezclas de disolventes, dan lugar a una separación diferente. [5] El factor de retardo ( R f ), o factor de retención , cuantifica los resultados. Es la distancia recorrida por una sustancia dada dividida por la distancia recorrida por la fase móvil. [ cita requerida ]
En la TLC en fase normal , la fase estacionaria es polar . El gel de sílice es muy común en la TLC en fase normal. Los compuestos más polares en una mezcla de muestra interactúan más fuertemente con la fase estacionaria polar. [ cita requerida ] Como resultado, los compuestos más polares se mueven menos (resultando en un R f más bajo ) mientras que los compuestos menos polares se mueven más arriba en la placa ( R f más alto ). [10] Una fase móvil más polar también se une más fuertemente a la placa, compitiendo más con el compuesto por los sitios de unión; una fase móvil más polar también disuelve más los compuestos polares. [10] Como tal, todos los compuestos en la placa de TLC se mueven más arriba en la placa en mezclas de solventes polares. [ cita requerida ] Los solventes "fuertes" mueven los compuestos más arriba en la placa, mientras que los solventes "débiles" los mueven menos. [11]
Si la fase estacionaria no es polar, como las placas de sílice funcionalizadas con C18 , se denomina TLC de fase inversa . En este caso, los compuestos no polares se mueven menos y los compuestos polares se mueven más. [ cita requerida ] La mezcla de solventes también será mucho más polar que en la TLC de fase normal. [11]
Una serie eluotrópica , que ordena los solventes según cuánto mueven los compuestos, puede ayudar a seleccionar una fase móvil. [5] Los solventes también se dividen en grupos de selectividad de solventes. [5] [12] El uso de solventes con diferentes puntos de elución o diferentes grupos de selectividad a menudo puede dar resultados muy diferentes. [5] [12] Si bien las fases móviles de un solo solvente a veces pueden dar una buena separación, algunos casos pueden requerir mezclas de solventes. [13]
En la TLC de fase normal, las mezclas de disolventes más comunes incluyen acetato de etilo/hexanos ( EtOAc / Hex ) para compuestos menos polares y metanol/diclorometano ( MeOH / DCM ) para compuestos más polares. [14] Diferentes mezclas de disolventes y proporciones de disolventes pueden ayudar a lograr una mejor separación. [15] En la TLC de fase inversa, las mezclas de disolventes son típicamente agua con un disolvente menos polar: las opciones típicas son agua con tetrahidrofurano ( THF ), acetonitrilo ( ACN ) o metanol. [14]
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Como los productos químicos que se separan pueden ser incoloros, existen varios métodos para visualizar las manchas:
Las placas de TLC suelen estar disponibles comercialmente, con rangos de tamaño de partícula estándar para mejorar la reproducibilidad . [4] Se preparan mezclando el adsorbente, como gel de sílice , con una pequeña cantidad de aglutinante inerte como sulfato de calcio (yeso) y agua. [18] Esta mezcla se extiende como una suspensión espesa sobre una hoja portadora no reactiva, generalmente vidrio , papel de aluminio grueso o plástico. La placa resultante se seca y se activa calentándola en un horno durante treinta minutos a 110 °C. [18] El espesor de la capa absorbente suele ser de alrededor de 0,1 a 0,25 mm para fines analíticos y de alrededor de 0,5 a 2,0 mm para TLC preparativa. [19] Otros recubrimientos adsorbentes incluyen óxido de aluminio (alúmina) o celulosa . [18]
La TLC es una herramienta útil para el seguimiento de la reacción. [15] Para ello, la placa normalmente contiene un punto de material de partida, un punto de la mezcla de reacción y un punto co-punto (o punto cruzado) que contiene ambos. [4] [14] El análisis mostrará si el material de partida desapareció y si aparecieron nuevos productos. [14] Esto proporciona una forma rápida y sencilla de estimar hasta dónde ha llegado una reacción. En un estudio, la TLC se ha aplicado en la detección de reacciones orgánicas . [20] Los investigadores hacen reaccionar un alcohol y un catalizador directamente en el punto co-punto de una placa de TLC antes de revelarla. Esto proporciona una prueba rápida y sencilla a pequeña escala de diferentes reactivos .
La caracterización de compuestos con TLC también es posible [ cita requerida ] y es similar al monitoreo de la reacción. Sin embargo, en lugar de detectar el material de partida y la mezcla de reacción, se trata de un compuesto desconocido y uno conocido. Pueden ser el mismo compuesto si ambos puntos tienen el mismo R f y se ven iguales bajo el método de visualización elegido. [ cita requerida ] Sin embargo, la coelución complica tanto el monitoreo de la reacción como la caracterización. Esto se debe a que diferentes compuestos se moverán al mismo punto en la placa. En tales casos, diferentes mezclas de solventes pueden proporcionar una mejor separación. [21]
La cromatografía en capa fina (TLC) ayuda a mostrar la pureza de una muestra. [ cita requerida ] Una muestra pura solo debe contener una mancha mediante cromatografía en capa fina. La TLC también es útil para la purificación a pequeña escala. [22] Debido a que los compuestos separados estarán en diferentes áreas de la placa, un científico puede raspar las partículas de la fase estacionaria que contienen el compuesto deseado y disolverlas en un solvente apropiado. [22] Una vez que todo el compuesto se disuelve en el solvente, filtran las partículas de sílice y luego evaporan el solvente para aislar el producto. Las placas de TLC preparativas grandes con recubrimientos gruesos de gel de sílice pueden separar más de 100 mg de material. [22]
Para la purificación y el aislamiento a mayor escala, la cromatografía en capa fina (TLC) es útil para probar rápidamente mezclas de solventes antes de ejecutar la cromatografía en columna flash en un lote grande de material impuro. [13] [23] Un compuesto se eluye de una columna cuando la cantidad de solvente recolectada es igual a 1/ R f . [24] El eluyente de la cromatografía en columna flash se recolecta en varios recipientes (por ejemplo, tubos de ensayo) llamados fracciones. La TLC ayuda a mostrar qué fracciones contienen impurezas y cuáles contienen compuesto puro. [ cita requerida ]
Además, la cromatografía en capa fina bidimensional [4] puede ayudar a comprobar si un compuesto es estable en una fase estacionaria concreta. Esta prueba requiere dos pasadas en una placa de cromatografía en capa fina de forma cuadrada. La placa se gira 90º antes de la segunda pasada. Si el compuesto de interés aparece en la diagonal del cuadrado, es estable en la fase estacionaria elegida. De lo contrario, se está descomponiendo en la placa. Si este es el caso, una fase estacionaria alternativa puede evitar esta descomposición. [25]
La TLC también es un método analítico para la separación directa de enantiómeros y el control de la pureza enantiomérica, por ejemplo, ingredientes farmacéuticos activos ( API ) que son quirales. [26]
