La faloidina pertenece a una clase de toxinas llamadas falotoxinas , que se encuentran en el hongo Amanita phalloides . Es un heptapéptido bicíclico rígido que es letal después de unos días cuando se inyecta en el torrente sanguíneo. El síntoma principal de la intoxicación por faloidina es el hambre aguda debido a la destrucción de las células del hígado. Funciona uniendo y estabilizando la actina filamentosa ( F-actina ) y previene eficazmente la despolimerización de las fibras de actina. Debido a su unión estrecha y selectiva a la F-actina, los derivados de la faloidina que contienen etiquetas fluorescentes se utilizan ampliamente en microscopía para visualizar la F-actina en la investigación biomédica.
La faloidina fue uno de los primeros péptidos cíclicos que se descubrieron. Fue aislada del hongo de la muerte y cristalizada por Feodor Lynen y Ulrich Wieland [1] en 1937. [2] Su estructura es inusual, ya que contiene un enlace cisteína - triptófano para formar un heptapéptido bicíclico. Este enlace no se había caracterizado antes y hace que la elucidación de la estructura de la faloidina sea significativamente más difícil. Determinaron la presencia del átomo de azufre utilizando espectroscopia UV y descubrieron que esta estructura de anillo tenía una longitud de onda ligeramente desplazada. Los experimentos de níquel Raney confirmaron la presencia de azufre en el anillo de triptófano. Los investigadores descubrieron que la faloidina desulfurada seguía siendo circular, lo que demostró que la estructura de la faloidina es normalmente bicíclica. Una vez linealizada, la secuencia de aminoácidos de la faloidina desulfurada fue elucidada mediante degradación de Edman por Wieland y Schön en 1955. [3]
Debido a su alta afinidad por la actina, los científicos descubrieron su uso potencial como reactivo de tinción para la visualización eficaz de la actina en el microscopio. Los derivados conjugados con fluoróforos se venden ampliamente. Debido a su capacidad para unirse selectivamente a la actina filamentosa (F-actina) y no a los monómeros de actina (G-actina), la faloidina marcada con fluorescencia es más eficaz que los anticuerpos contra la actina. [4]
La faloidina es un heptapéptido bicíclico que contiene un enlace cisteína-triptófano inusual. El gen que codifica la síntesis de la faloidina es parte de la familia MSDIN en el hongo Death Cap y codifica un propéptido de 34 aminoácidos. Un residuo de prolina flanquea la región de siete residuos que luego se convertirá en faloidina. Después de la traducción, el péptido debe ser escindido proteolíticamente, ciclizado, hidroxilado, reticulado con Trp-Cys para formar triptationina y epimerizado para formar un D-Thr. El orden y el mecanismo bioquímico exacto para estos pasos aún no se comprenden por completo. La creencia actual es que los genes biosintéticos necesarios están agrupados cerca de los genes MSDIN. [5]
La primera modificación postraduccional del 34-mer es la escisión proteolítica a través de una prolil oligopeptidasa (POP) para eliminar el péptido "líder" de 10 aminoácidos. A continuación, la POP cicla el heptapéptido Ala-Trp-Leu-Ala-Thr-Cys-Pro mediante la transpeptidación entre el aminoácido 1 (Ala) y el aminoácido 7 (Pro). Se cree que la formación de triptationina a través de la reticulación Trp-Cys ocurre a continuación. [5]
Dado que la faloidina se utiliza por su capacidad de unirse y estabilizar los polímeros de actina, pero las células no pueden absorberla fácilmente, los científicos han descubierto que los derivados de la faloidina son más útiles en la investigación. Básicamente, sigue la típica síntesis de péptidos pequeños, utilizando hidroxi-prolina. La principal dificultad en la síntesis es la formación del enlace triptationina (enlace cruzado cisteína-triptófano).
A continuación se muestra el mecanismo sintético general llevado a cabo por Anderson et al. en 2005 para la síntesis en fase sólida de ala 7 -faloidina, que difiere en el residuo 7 de la faloidina como se indica a continuación. [6] THPP significa tetrahidropiranil poliestireno enlazador, que se utiliza para conectar la molécula con el soporte sólido durante la síntesis. Tenga en cuenta que la síntesis a continuación es simplemente un esquema general para mostrar el orden de formación de enlaces para conectar los materiales de partida. Ala 7 -faloidina, así como muchas otras variantes similares de faloidina, son útiles para aumentar la captación celular en relación con la faloidina y para unir un fluoróforo para ayudar en la visualización de F-actina en microscopía.
La primera síntesis total de faloidina se logró mediante una combinación de síntesis en fase sólida y en fase de solución (Baosheng Liu y Jianheng Zhang, patente de los Estados Unidos, US 8.569.452 B2). Las propiedades físicas y químicas de la faloidina sintética son las mismas que las de la faloidina natural.
La faloidina se une a la F- actina , evitando su despolimerización y envenenando la célula. La faloidina se une específicamente en la interfaz entre las subunidades de F-actina, bloqueando juntas las subunidades adyacentes. La faloidina, un heptapéptido bicíclico, se une a los filamentos de actina mucho más fuertemente que a los monómeros de actina, lo que lleva a una disminución en la constante de velocidad para la disociación de las subunidades de actina de los extremos del filamento, lo que esencialmente estabiliza los filamentos de actina a través de la prevención de la despolimerización del filamento. [7] Además, se ha descubierto que la faloidina inhibe la actividad de hidrólisis de ATP de la F-actina. [8] Por lo tanto, la faloidina atrapa los monómeros de actina en una conformación distinta de la G-actina y estabiliza la estructura de la F-actina al reducir en gran medida la constante de velocidad para la disociación del monómero, un evento asociado con el atrapamiento de ADP. [8] En general, se ha descubierto que la faloidina reacciona estequiométricamente con la actina, promueve fuertemente la polimerización de la actina y estabiliza los polímeros de actina. [9]
La faloidina funciona de manera diferente en distintas concentraciones en las células. Cuando se introduce en el citoplasma en concentraciones bajas, la faloidina recluta las formas menos polimerizadas de actina citoplasmática, así como la filamina, en "islas" estables de polímeros de actina agregados, pero no interfiere con las fibras de estrés, es decir, haces gruesos de microfilamentos. [9] Wehland et al. también señala que en concentraciones más altas, la faloidina induce la contracción celular. [9]
Poco después de su descubrimiento, los científicos inyectaron faloidina a ratones y descubrieron que su LD 50 es de 2 mg/kg mediante inyección intraperitoneal . Cuando se expusieron a la dosis letal mínima, estos ratones tardaron varios días en morir. El único efecto secundario aparente del envenenamiento con faloidina es el hambre extrema. Esto se debe a que la faloidina solo es absorbida por el hígado a través de las proteínas transportadoras de membrana de sales biliares. [10] Una vez dentro del hígado, la faloidina se une a la F-actina, impidiendo su despolimerización. Este proceso lleva tiempo para destruir las células hepáticas. Los riñones también pueden absorber faloidina, pero no con tanta eficacia como el hígado. En este caso, la faloidina causa nefrosis. [11]
Las propiedades de la faloidina la convierten en una herramienta útil para investigar la distribución de la F-actina en las células mediante el marcado de la faloidina con análogos fluorescentes y su uso para teñir filamentos de actina para microscopía óptica. Los derivados fluorescentes de la faloidina han resultado ser enormemente útiles para localizar filamentos de actina en células vivas o fijadas, así como para visualizar filamentos de actina individuales in vitro . [7] Se desarrolló una técnica de alta resolución para detectar la F-actina a nivel de microscopio electrónico y óptico mediante el uso de faloidina conjugada con el fluoróforo eosina , que actúa como etiqueta fluorescente. [12] En este método, conocido como fotooxidación fluorescente, se pueden utilizar moléculas fluorescentes para impulsar la oxidación de la diaminobencidina (DAB) para crear un producto de reacción que se puede volver denso en electrones y detectable mediante microscopía electrónica. [12] La cantidad de fluorescencia visualizada se puede utilizar como una medida cuantitativa de la cantidad de actina filamentosa que hay en las células si se utilizan cantidades saturantes de faloidina fluorescente. [7] En consecuencia, la microscopía de inmunofluorescencia junto con la microinyección de faloidina se puede utilizar para evaluar las funciones directas e indirectas de la actina citoplasmática en sus diferentes etapas de formación de polímeros. [9] Por lo tanto, la faloidina fluorescente se puede utilizar como una herramienta importante en el estudio de redes de actina a alta resolución.
La faloidina es mucho más pequeña que un anticuerpo que normalmente se usaría para marcar proteínas celulares para microscopía fluorescente, lo que permite un etiquetado mucho más denso de la actina filamentosa y se pueden adquirir imágenes mucho más detalladas, particularmente a resoluciones más altas.
Las faloidinas no modificadas no atraviesan las membranas celulares, lo que las hace menos eficaces en experimentos con células vivas. Se han sintetizado derivados de la faloidina con una permeabilidad celular muy aumentada.
Las células tratadas con faloidinas presentan una serie de efectos tóxicos y con frecuencia mueren. [7] Además, es importante señalar que las células tratadas con faloidina tendrán mayores niveles de actina asociada a sus membranas plasmáticas, y la microinyección de faloidina en células vivas cambiará la distribución de actina, así como la motilidad celular. [7]
