La peroxidasa eosinofílica es una enzima que se encuentra dentro de los granulocitos eosinófilos , células inmunes innatas de humanos y mamíferos. Esta proteína oxidorreductasa está codificada por el gen EPX , expresado dentro de estas células mieloides. La EPO comparte muchas similitudes con sus peroxidasas ortólogas , mieloperoxidasa (MPO), lactoperoxidasa (LPO) y peroxidasa tiroidea (TPO). La proteína se concentra en gránulos secretores dentro de los eosinófilos. La peroxidasa eosinofílica es una hemoperoxidasa , sus actividades incluyen la oxidación de iones haluro a especies reactivas de oxígeno bactericidas , la disrupción catiónica de las paredes celulares bacterianas y la modificación postraduccional de residuos de aminoácidos de proteínas.
La función principal de la peroxidasa de los eosinófilos es catalizar la formación de ácidos hipohalosos a partir de peróxido de hidrógeno e iones haluro en solución. Por ejemplo:
Los ácidos hipohalosos formados a partir de haluros o pseudohaluros son potentes agentes oxidantes. [a] Sin embargo, el papel de la peroxidasa eosinofílica parece ser generar ácidos hifalosos principalmente a partir de bromuro y yoduro en lugar de cloruro, ya que los primeros son favorecidos en gran medida sobre los segundos. La enzima mieloperoxidasa es responsable de la formación de la mayor parte del ácido hipocloroso en el cuerpo, y la peroxidasa eosinofílica es responsable de las reacciones que involucran bromuro y yoduro.
Se ha descubierto que el marco de lectura abierto de la peroxidasa de eosinófilos humana tiene una longitud de 2106 pares de bases (pb). Este comprende una prosecuencia de 381 pb, una secuencia de 333 pb que codifica la cadena ligera y una secuencia de 1392 pb que codifica la cadena pesada. Además de estas, hay una región no traducida de 452 pb en el extremo 3' que contiene la señal de poliadenilación AATAAA . [5]
La secuencia promotora de la peroxidasa de eosinófilos humana es un promotor inusualmente fuerte. Todos los elementos reguladores principales se encuentran dentro de los 100 pb antes del gen. [6]
El perfil de expresión de EPX se ha caracterizado y está disponible en línea a través de BioGPS. Este conjunto de datos indica que, tanto en humanos como en ratones, EPX solo se expresa en la médula ósea. A este nivel, es más de 30 veces el nivel promedio de expresión en todos los tejidos del cuerpo.
Durante la maduración, la cadena polipeptídica se transforma proteolíticamente en una cadena pesada y una ligera. Sin embargo, ambas cadenas siguen estando íntimamente unidas, sobre todo por el cofactor hemo unido mediante enlaces covalentes. La proteína se produce en los ribosomas incrustados en la superficie del retículo endoplasmático, ya que finalmente debe localizarse en los gránulos. La proteína precursora pasa por los siguientes pasos de procesamiento antes de activarse:
A diferencia de la MPO, el hemo de la EPO no está unido a través de la metionina, lo que afecta las características catalíticas (véase el sitio activo). [9]
La peroxidasa de los eosinófilos es una enzima que contiene predominantemente hélices α del grupo hemo . El núcleo del dominio catalítico que rodea el sitio activo consta de seis hélices α, cinco de la cadena polipeptídica pesada y una de la ligera. [11] El pliegue de la enzima se conoce como el pliegue de la peroxidasa del grupo hemo, que se conserva entre todos los miembros de esta familia de genes. Sin embargo, no todos los miembros poseen actividad peroxidasa. [9]
El sitio de unión del ion calcio tiene una geometría bipiramidal pentagonal típica . Está unido dentro de un bucle de ocho residuos de la cadena pesada. Los ligandos son proporcionados por los grupos hidroxilo de serina y treonina; carbonilo de la cadena principal; y ácido carboxílico, uno de los cuales proviene de la cadena polipeptídica ligera. El sitio de calcio sirve no solo como andamio para el plegamiento de proteínas, sino también para la asociación adecuada de las dos cadenas. De hecho, cuando se elimina el ion calcio, la proteína precipita fuera de la solución. [11]
La proteína contiene un solo dominio modular . En este sentido, es principalmente una enzima metabólica o un efector terminal; tiene un papel pequeño en las vías de señalización celular. La estructura general de las cuatro hemo peroxidasas de mamíferos (MPO, LPO, EPO y TPO) es casi idéntica. [9] Sin embargo, la MPO es única al existir como un dímero catalítico unido por un enlace disulfuro. [10] Uno de los primeros aspectos conocidos de la peroxidasa de eosinófilos fue que era altamente catiónica, como lo indica su alto punto isoeléctrico (ver Proteína). La peroxidasa de eosinófilos no se ha caracterizado por cristalografía de rayos X. Sin embargo, una correspondencia directa entre los espectros de absorción de EPO, TPO y LPO, así como una alta similitud de secuencia, nos permite comparar las propiedades de los tres. Las características de la mieloperoxidasa son algo diferentes, debido a su estado de multimerización, así como a su enlace hemo alternativo. Además, se ha creado un modelo de homología para EPO basado en la estructura de difracción de rayos X. [10]
El pliegue está muy conservado y parece estar optimizado para la función catalítica. Sin embargo, existen diferencias que, como era de esperar, explican las diferencias en la especificidad del sustrato entre las peroxidasas. Esta furcación es común en el estudio de la evolución de las proteínas. Las características estructurales que son muy necesarias para la función están sujetas a una fuerte presión de conservación, mientras que las regiones distantes del sitio activo experimentan una deriva genética. Esto puede conducir a la especialización o diferenciación de la función que surge de la modificación de una fracción central enzimática. Por ejemplo, la peroxidasa tiroidea, estrechamente relacionada, cataliza una reacción de oxidación específica en la biosíntesis de una hormona, mientras que otras hemo peroxidasas cumplen funciones en la defensa inmunitaria y la señalización redox.
Se sabe que la EPO humana existe como un monómero soluble . [9]
El sitio activo de la peroxidasa de eosinófilos contiene un solo átomo de hierro en complejación tetradentada con un cofactor de protoporfirina IX . Es notable que este grupo prostético esté unido covalentemente al polipéptido a través de enlaces éster . Asp232 y Glu380 de EPO están unidos covalentemente a través de sus átomos de oxígeno terminales a las cadenas laterales modificadas de la protoporfirina. [9] A modo de comparación, en la mieloperoxidasa, hay un tercer punto de unión, Met243, que forma un puente de iones de sulfonio con el grupo vinilo colgante en el hemo. Esta característica está ausente en EPO y el residuo correspondiente es treonina .
El quinto ligando del hierro es un residuo de histidina conservado , unido por puentes de hidrógeno directamente a un residuo de asparagina . [9] Estos dos residuos críticos garantizan que el hierro tenga un potencial de reducción Fe(III)/Fe(II) adecuado para la catálisis. Se dice que los sextos ligandos del hierro están ubicados en el lado distal del grupo hemo. Estos incluyen una red corta de agua que comprende cinco moléculas; estabilizada por puentes de hidrógeno con residuos de histidina, glutamina y arginina. [9] La cara distal se utiliza para la unión del sustrato y la catálisis.
Las estructuras cristalinas de MPO se han resuelto tanto en estados nativos como con inhibidores unidos y están depositadas en el Banco de Datos de Proteínas con los números de acceso 1CXP, 1D5L, 1D2V y 1D7W.
El mecanismo básico de las hemo peroxidasas consiste en utilizar peróxido de hidrógeno para producir una forma activada del cofactor hemo, en la que el hierro adopta el estado de oxidación +4. El oxígeno activado puede entonces transferirse a un sustrato para convertirlo en una especie reactiva de oxígeno. [9] Existen tres ciclos distintos por los que puede pasar la EPO. El primero es el ciclo de halogenación:
donde Por denota el cofactor del hemo y • denota un radical químico . Este estado activado del hemo se denomina compuesto I. En este estado, el oxígeno podría describirse como una especie de oxiferrilo. Se cree que el radical porfirina del catión pi experimenta reactividad en los puentes de metino que conectan los cuatro anillos. La reducción del compuesto I en presencia de haluros X − se produce de la siguiente manera:
De esta manera, el compuesto I se reduce nuevamente al estado de reposo de la enzima y los iones haluro unidos en la cavidad distal se oxidan a potentes agentes oxidantes.
Sin embargo, existe un segundo ciclo en el que el compuesto I puede proceder a través de dos pasos de reducción de un electrón para oxidar sustratos arbitrarios a sus formas radicales. Este proceso opera en la mayoría de los sustratos que no son haluros. El primer paso es idéntico, seguido de:
Las implicaciones fisiológicas de este segundo mecanismo son importantes. Se ha demostrado que la peroxidasa de los eosinófilos oxida los residuos de tirosina en las proteínas, lo que también se ha relacionado con las cascadas de señalización reactiva del oxígeno. [12]
El tercer mecanismo, menos relevante, es la actividad catalasa de las peroxidasas. Este mecanismo parece funcionar sólo en ausencia de donantes de un electrón. [9]
La peroxidasa de eosinófilos cataliza la reacción de la haloperoxidasa . La EPO puede tomar cloruro, bromuro y yoduro como sustratos, así como el pseudohaluro tiocianato (SCN − ). [13] [14] [15] Sin embargo, la enzima prefiere el bromuro sobre el cloruro, el yoduro sobre el bromuro y el tiocianato sobre el yoduro, con respecto a las velocidades de reacción . De hecho, solo la mieloperoxidasa puede oxidar el cloruro a una velocidad considerable. La velocidad de catálisis del yoduro es cinco órdenes de magnitud mayor que la velocidad de catálisis del cloruro, a modo de comparación. [9] El mutante de MPO en el que Met243 ligado al hemo se mutó de forma no conservativa mostró una falta de capacidad de cloración, lo que implica a este residuo o a su grupo funcional peculiar en la especificidad del sustrato. [9]
El cianuro se une muy fuertemente a las hemo peroxidasas de los mamíferos. La unión directa y fuerte al hierro del hemo convierte la proteína en una especie de bajo espín . [9] La unión del cianuro requiere la forma desprotonada de un grupo con pKa de 4,0-4,3. Este parece ser el residuo de histidina distal. Se cree que la estructura del complejo ternario de MPO, cianuro y bromuro es un buen modelo para el complejo compuesto I-haluro debido a su geometría similar (cf. 1D7W). El ion nitrito también se une fuertemente, formando un hemo de bajo espín. [9]
Uno de los primeros mutantes bien caracterizados de EPX fue una transición G→A que resultó en una mutación no conservativa a nivel de proteína. [16]
Los organismos multicelulares grandes utilizan múltiples sistemas como defensa contra bacterias infecciosas o parásitos invasores. Una estrategia, que cae dentro del dominio de la inmunidad celular , depende de la acción de enzimas que catalizan la reacción de la peroxidasa. La peroxidasa de los eosinófilos se puede encontrar en los gránulos primarios (azurófilos) de los leucocitos humanos y de los mamíferos. La localización de la peroxidasa en los leucocitos se ha estudiado a lo largo del siglo XX utilizando agentes de tinción como el clorhidrato de bencidina. [17] Antes de la introducción de la tinción inmunorreactiva específica, estos indicadores químicos de la actividad enzimática eran habituales. Tras la llegada del microscopio electrónico , se investigó enérgicamente la ultraestructura de muchos tipos de células. Posteriormente, se descubrió que la peroxidasa de los eosinófilos se localizaba en los gránulos primarios y secundarios del eosinófilo. [18]
Los eosinófilos forman parte del linaje mielocítico , una de las dos clases principales de tipos de células derivadas de la médula ósea (junto con los linfocitos ) que circulan en la sangre y la linfa y desempeñan papeles críticos en las respuestas inmunitarias . La peroxidasa eosinofílica es secretada por las células eosinofílicas en el tejido en el sitio de la infección. La activación de las células ante una infección conduce a la liberación del contenido de los gránulos y a la externalización de proteínas y agentes químicos de la célula.
Habiéndose separado de la mieloperoxidasa y la lactoperoxidasa, estas tres enzimas ahora desempeñan funciones distintas pero no superpuestas: la lactoperoxidasa ayuda a mantener la esterilidad de la leche de mamíferos; la mieloperoxidasa y la peroxidasa eosinofílica habitan en los gránulos y desempeñan funciones en la defensa del huésped, un ejemplo de cómo el concepto de una única función química puede aprovecharse de innumerables maneras en la naturaleza.
La deficiencia específica de la peroxidasa de los eosinófilos sin deficiencia concomitante de mieloperoxidasa es rara. [19] En un entorno clínico, las deficiencias de las enzimas leucocitarias se estudian convenientemente mediante citometría de flujo óptica . [19] Las deficiencias específicas de la mieloperoxidasa se conocían desde la década de 1970. La deficiencia de mieloperoxidasa resultó en una ausencia de tinción de peroxidasa en los neutrófilos pero no en los eosinófilos. [20] Los primeros estudios sobre la deficiencia de mieloperoxidasa revelaron que las variantes de la enfermedad más comunes eran mutaciones sin sentido, incluida la del residuo de metionina ligado al hemo. [21] Esta deficiencia a menudo no se heredaba como un rasgo autosómico recesivo simple sino más bien como una mutación heterocigótica compuesta. [22] Se cree que los pacientes con deficiencia de mieloperoxidasa tienen una mayor incidencia de tumores malignos. Sin embargo, no tienen una tasa significativamente mayor de infección, debido a la redundancia en los mecanismos inmunes mediados por la peroxidasa. [23]
