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En biología , un subcultivo es un nuevo cultivo celular o un cultivo microbiológico realizado transfiriendo algunas o todas las células de un cultivo anterior a un medio de crecimiento nuevo . Esta acción se llama subcultivo o pase de células. El subcultivo se utiliza para prolongar la vida útil y/o aumentar el número de células o microorganismos en el cultivo. [1]
Las líneas celulares y los microorganismos no pueden mantenerse en cultivo indefinidamente debido al aumento gradual de metabolitos que pueden ser tóxicos , el agotamiento de los nutrientes presentes en el medio de cultivo y un aumento en el recuento de células o el tamaño de la población debido al crecimiento. Una vez que se agotan los nutrientes y aumentan los niveles de subproductos tóxicos, los microorganismos en cultivo entrarán en la fase estacionaria , donde la proliferación se reduce considerablemente o cesa (el valor de densidad celular se estabiliza). Cuando los microorganismos de este cultivo se transfieren a medios frescos, los nutrientes desencadenan el crecimiento de los microorganismos que pasarán por una fase de retraso , un período de crecimiento lento y adaptación al nuevo entorno, seguido de una fase logarítmica , un período en el que las células crecen exponencialmente. [1]
Por lo tanto, el subcultivo se utiliza para producir un nuevo cultivo con una menor densidad de células que el cultivo original, nutrientes frescos y sin metabolitos tóxicos que permitan el crecimiento continuo de las células sin riesgo de muerte celular. El subcultivo es importante tanto para las células proliferantes (por ejemplo, un microorganismo como E. coli ) como para las no proliferativas (por ejemplo, glóbulos blancos terminalmente diferenciados ). El subcultivo también se puede utilizar para calcular la curva de crecimiento (por ejemplo, tiempo de generación) [2] y obtener microorganismos en fase logarítmica para experimentos (por ejemplo, transformación bacteriana). [3]
Normalmente, el subcultivo se realiza a partir de un cultivo de cierto volumen en un medio de crecimiento fresco de igual volumen, lo que permite el mantenimiento a largo plazo de la línea celular. El subcultivo en un volumen mayor de medio de crecimiento se utiliza cuando se desea aumentar el número de células para, por ejemplo, utilizarlas en un proceso industrial o en un experimento científico.
A menudo es importante registrar el número aproximado de divisiones que han tenido las células en cultivo registrando el número de pases o subcultivos. En el caso de células de tejido vegetal , la variación somaclonal puede surgir durante largos períodos en cultivo. De manera similar, en las líneas celulares de mamíferos , las aberraciones cromosómicas tienden a aumentar con el tiempo. Para los microorganismos existe una tendencia a adaptarse a las condiciones de cultivo, que rara vez son exactamente iguales al entorno natural del microorganismo, lo que puede alterar su biología.
El protocolo para el subcultivo de células depende en gran medida de las propiedades de las células implicadas.
Muchos tipos de células, en particular muchos microorganismos, crecen en solución y no adheridos a una superficie. Estos tipos de células se pueden subcultivar simplemente tomando un pequeño volumen del cultivo original y diluyéndolo en un medio de crecimiento nuevo. La densidad celular en estos cultivos normalmente se mide en células por mililitro para células eucariotas grandes, o como densidad óptica para luz de 600 nm para células más pequeñas como las bacterias. Las células a menudo tendrán un rango preferido de densidades para un crecimiento óptimo y el subcultivo normalmente intentará mantener las células en este rango.
Las células adherentes, por ejemplo muchas líneas celulares de mamíferos, crecen adheridas a una superficie como el fondo de un matraz de cultivo celular o una placa de Petri. Estos tipos de células deben desprenderse de la superficie antes de poder subcultivarlos. Para las células adherentes, la densidad celular normalmente se mide en términos de confluencia , el porcentaje de la superficie de crecimiento cubierta por las células. Las células a menudo tendrán un rango conocido de confluencias para un crecimiento óptimo; por ejemplo, una línea celular de mamífero como HeLa generalmente prefiere confluencias entre el 10% y el 100%, y el subcultivo normalmente intentará mantener las células en este rango. Para el subcultivo, las células se pueden separar mediante uno de varios métodos, incluido el tratamiento con tripsina para descomponer las proteínas responsables de la adherencia a la superficie, la quelación de iones de calcio con EDTA , que altera algunos mecanismos de adherencia de las proteínas, o métodos mecánicos como el lavado repetido o el uso de un raspador de células. Luego, las células desprendidas se resuspenden en medio de crecimiento nuevo y se les permite asentarse nuevamente en su superficie de crecimiento.