p14ARF (también llamado supresor de tumores ARF , ARF , p14 ARF ) es un producto proteico del marco de lectura alternativo del locus CDKN2A (es decir, locus INK4a / ARF ). [1] p14ARF se induce en respuesta a una estimulación mitogénica elevada , como la señalización de crecimiento aberrante de MYC y Ras (proteína) . [2] Se acumula principalmente en el nucléolo donde forma complejos estables con NPM o Mdm2 . Estas interacciones permiten que p14ARF actúe como un supresor de tumores al inhibir la biogénesis de ribosomas o iniciar la detención del ciclo celular dependiente de p53 y la apoptosis , respectivamente. [3] p14ARF es una proteína atípica, en términos de su transcripción, su composición de aminoácidos y su degradación: se transcribe en un marco de lectura alternativo de una proteína diferente, es altamente básica, [1] y está poliubiquinada en el extremo N. [4]
Tanto p16INK4a como p14ARF participan en la regulación del ciclo celular . p14ARF inhibe mdm2 , promoviendo así p53 , que promueve la activación de p21 , que luego se une e inactiva ciertos complejos ciclina - CDK , que de otro modo promoverían la transcripción de genes que llevarían a la célula a través del punto de control G 1 /S del ciclo celular. La pérdida de p14ARF por una mutación homocigótica en el gen CDKN2A ( INK4A ) conducirá a niveles elevados en mdm2 y, por tanto, a la pérdida de la función de p53 y del control del ciclo celular.
El equivalente en ratones es p19ARF.
La transcripción p14ARF se identificó por primera vez en humanos en 1995, [5] [6] y su producto proteico se confirmó en ratones ese mismo año. [7] Su locus genético está en el brazo corto del cromosoma 9 en humanos y en una ubicación correspondiente en el cromosoma 4 en ratones. [1] Se encuentra cerca de los genes de las repeticiones en tándem INK4a e INK4b, que son proteínas de 16 kDa (p16 INK4a ) y 15 kDa (p15 INK4b ), respectivamente. Estas proteínas INK4 inhiben directamente las quinasas CDK4 y CDK6 dependientes de ciclina D. Hay otros genes INK4 en otros cromosomas; sin embargo, estos no están relacionados con el cáncer , por lo que no es probable que sus funciones se superpongan. Un sustrato importante dependiente de ciclina es la proteína Rb del retinoblastoma, que se fosforila en la fase tardía del intervalo 1 ( fase G1 ), lo que permite la salida de G1. La proteína Rb limita la proliferación celular al bloquear la actividad de los factores de transcripción E2F , que activan la transcripción de genes necesarios para la replicación del ADN . Cuando Rb es fosforilada por quinasas dependientes de ciclina D y E durante la fase G1 del ciclo celular, Rb no puede bloquear la transcripción dependiente de E2F y la célula puede progresar a la fase sintética de ADN ( fase S ). [8] Por lo tanto, INK4a e INK4b sirven como supresores de tumores al restringir la proliferación mediante la inhibición de las CDK responsables de la fosforilación de Rb . [7]
Además de la proteína INK4a, la proteína no relacionada, ARF, se transcribe desde un marco de lectura alternativo en el locus INK4a/ARF. [1] Los ARNm de INK4a y p14ARF constan cada uno de tres exones . Comparten los exones 2 y 3, pero hay dos transcripciones diferentes del exón 1, α y β. El exón 1β (E1β) está intercalado entre los genes de INK4a e INK4b. [1] Aunque el exón 1α (E1α) y E1β son aproximadamente iguales en términos de contenido y tamaño, el 5' AUG ( codón de inicio ) del exón 1β tiene su propio promotor y abre un marco de lectura alternativo en el exón 2, de ahí el nombre. p14ARF (el exón 3 de ARF no está traducido). Debido a esto, INK4a y p14ARF tienen secuencias de aminoácidos no relacionadas a pesar de superponerse regiones codificantes y tienen funciones distintas. Este uso dual de secuencias codificantes no se observa comúnmente en mamíferos, lo que convierte a p14ARF en una proteína inusual. [1] Cuando se encontró la transcripción ARF β, se pensó que probablemente no codificaría una proteína. [5] [6] En humanos, ARF se traduce en la proteína [[p14 ARF ]] de 14 kDa y 132 aminoácidos , y en ratones, se traduce en la proteína p19 Arf de 19 kDa y 169 aminoácidos . [1] El segmento de proteína E1β del ARF de ratón y humano es 45% idéntico, con una identidad ARF general del 50%, en comparación con una identidad del 72% entre el segmento INK4a E1α de ratón y humano, y una identidad general del 65%. [7]
Aunque las proteínas INK4a y ARF son estructural y funcionalmente diferentes, ambas participan en la progresión del ciclo celular . En conjunto, su amplio papel inhibidor puede ayudar a contrarrestar las señales oncogénicas . Como se mencionó anteriormente, INK4a inhibe la proliferación al permitir indirectamente que Rb permanezca asociado con los factores de transcripción E2F . ARF participa en la activación de p53 al inhibir Mdm2 (HDM2 en humanos). [8] Mdm2 se une a p53, inhibiendo su actividad transcripcional. Mdm2 también tiene actividad ubiquitina ligasa E3 hacia p53 y promueve su exportación desde el núcleo celular al citoplasma para su degradación. Al antagonizar Mdm2, ARF permite la actividad transcripcional de p53 que conduciría a la detención del ciclo celular o la apoptosis . Por lo tanto, una pérdida de ARF o p53 daría a las células una ventaja de supervivencia. [1]
La función de ARF se ha atribuido principalmente a su mecanismo Mdm2/p53. Sin embargo, ARF también inhibe la proliferación en células que carecen de p53 o p53 y Mdm2. [9] En 2004 se descubrió que una de las funciones independientes de p53 de ARF implica su unión a nucleofosmina /B23 (NPM). [9] NPM es una chaperona (proteína) ribosomal ácida involucrada en el procesamiento preribosomal y la exportación nuclear independiente de p53, y se oligomeriza consigo misma y con p14 ARF . Casi la mitad de p14 ARF se encuentra en complejos que contienen NPM con alta masa molecular (2 a 5 MDa). La expresión forzada de ARF retarda el procesamiento temprano del precursor del ARNr 47S/45S e inhibe la escisión del ARNr 32S. Esto sugiere que p14 ARF puede unirse a NPM, inhibiendo el procesamiento de ARNr. [9] Las células ARF nulas tienen un área nucleolar aumentada, una mayor biogénesis de ribosomas y un aumento correspondiente en la síntesis de proteínas . [10] Sin embargo, el mayor tamaño resultante de más ribosomas y proteínas no está asociado con una mayor proliferación, y este fenotipo nulo de ARF ocurre a pesar de que los niveles basales normales de Arf generalmente son bajos. Derribar ARF con ARNip al exón 1β da como resultado un aumento de las transcripciones de ARNr, el procesamiento de ARNr y la exportación nuclear de ribosomas. La biogénesis desenfrenada de ribosomas que se observa cuando la NPM no está unida a ARF no ocurre si la NPM también está ausente. Aunque la inducción de ARF en respuesta a señales oncogénicas se considera de primordial importancia, los bajos niveles de ARF observados en las células en interfase también tienen un efecto considerable en términos de mantener bajo control el crecimiento celular. Por lo tanto, la función del ARF a nivel basal en el complejo NPM/ARF parece ser monitorear la biogénesis y el crecimiento de los ribosomas en estado estacionario independientemente de prevenir la proliferación. [10]
Muy comúnmente, el cáncer se asocia con una pérdida de función de INK4a, ARF, Rb o p53 . [11] Sin INK4a, Cdk4/6 puede fosforilar inapropiadamente Rb, lo que lleva a un aumento de la transcripción dependiente de E2F . Sin ARF, Mdm2 puede inhibir p53 de manera inapropiada, lo que lleva a una mayor supervivencia celular.
Se ha descubierto que el locus INK4a/ARF está eliminado o silenciado en muchos tipos de tumores. Por ejemplo, de los 100 carcinomas primarios de mama, aproximadamente el 41% tiene defectos de IRA p14 . [12] En un estudio separado, se encontró que el 32% de los adenomas colorrectales (tumores no cancerosos) tenían inactivación de p14 ARF debido a la hipermetilación del promotor . Los modelos de ratón que carecen de p19 Arf , p53 y Mdm2 son más propensos al desarrollo de tumores que los ratones sin Mdm2 y p53 solos. Esto sugiere que p19 Arf también tiene efectos independientes de Mdm2 y p53. [13] La investigación de esta idea condujo al reciente descubrimiento de smARF. [14]
Se ha descubierto que las deleciones homocigotas y otras mutaciones de CDK2NA (ARF) están asociadas con el glioblastoma . [15]
Hasta hace poco, los dos efectos conocidos de ARF eran la inhibición del crecimiento por interacciones de NPM y la inducción de apoptosis por interacciones de Mdm2 . La función de ARF que implica la muerte independiente de p53 ahora se ha atribuido a la pequeña isoforma mitocondrial de ARF, smARF. [14] Mientras que el ARF de longitud completa inhibe el crecimiento celular mediante la detención del ciclo celular o la muerte apoptótica de tipo I , el smARF mata las células mediante la muerte autofágica de tipo II. Al igual que ARF, la expresión de smARF aumenta cuando hay señales de proliferación aberrantes. Cuando se sobreexpresa smARF, se localiza en la matriz mitocondrial , dañando el potencial y la estructura de la membrana de las mitocondrias y provocando la muerte celular autofágica. [dieciséis]
La traducción del ARF truncado, smARF, se inicia en una metionina interna (M45) del transcrito de ARF en células humanas y de ratón. SmARF también se detecta en ratas, aunque no hay metionina interna presente en la transcripción de la rata. Esto sugiere que existe un mecanismo alternativo para formar smARF, lo que subraya la importancia de esta isoforma . [14] El papel de smARF es distinto del de ARF, ya que carece de la señal de localización nuclear (NLS) y no puede unirse a Mdm2 o NPM. [3] Sin embargo, en algunos tipos de células, la ARF de longitud completa también puede localizarse en las mitocondrias e inducir la muerte celular de tipo II, lo que sugiere que además de que la autofagia sea una inanición u otra respuesta ambiental, también puede estar involucrada en la respuesta al oncogén. activación. [2]
La expresión de ARF está regulada por señalización oncogénica . La estimulación mitogénica aberrante , como por MYC o Ras (proteína) , aumentará su expresión, al igual que una amplificación de p53 o Mdm2 mutados , o la pérdida de p53. [8] La IRA también puede inducirse mediante la expresión forzada de E2F . Aunque la expresión de E2F aumenta durante el ciclo celular , la expresión de ARF probablemente no lo sea porque podría ser necesaria la activación de un segundo factor de transcripción desconocido para prevenir una respuesta de ARF a aumentos transitorios de E2F. [11] ARF está regulado negativamente por complejos Rb-E2F [11] y por activación de p53 amplificada. [8] Las señales de crecimiento aberrantes también aumentan la expresión de smARF. [dieciséis]
ARF es una proteína altamente básica (pI>12) e hidrofóbica . [8] Su naturaleza básica se atribuye a su contenido de arginina; más del 20% de sus aminoácidos son arginina y contiene poca o ninguna lisina. Debido a estas características, es probable que ARF no esté estructurado a menos que esté vinculado a otros objetivos. Según se informa, forma complejos con más de 25 proteínas, aunque se desconoce el significado de cada una de estas interacciones. [1] Una de estas interacciones da como resultado una actividad sumoilante, lo que sugiere que ARF puede modificar las proteínas a las que se une. La proteína SUMO es un pequeño modificador similar a la ubiquitina , que se añade a los grupos lysly ε-amino. Este proceso implica una cascada de tres enzimas similar a la forma en que se produce la ubiquitilación . E1 es una enzima activadora, E2 es una enzima de conjugación y E3 es una ligasa. ARF se asocia con UBC9, el único SUMO E2 conocido, lo que sugiere que ARF facilita la conjugación de SUMO. Se desconoce la importancia de este papel, ya que la sumoilación está involucrada en diferentes funciones, como el tráfico de proteínas, la interferencia de la ubiquitilación y los cambios en la expresión genética. [1]
La vida media del ARF es de aproximadamente 6 horas, [4] mientras que la vida media del smARF es inferior a 1 hora. [3] Ambas isoformas se degradan en el proteosoma . [1] [4] ARF es el objetivo del proteosoma mediante ubiquitilación del extremo N. [4] Las proteínas suelen estar ubiquinadas en los residuos de lisina . Sin embargo, el [[p14 ARF ]] humano no contiene lisinas, y el p19 Arf de ratón solo contiene una lisina. Si la lisina del ratón se reemplaza con arginina, no hay ningún efecto sobre su degradación, lo que sugiere que también está ubiquinada en el extremo N. Esto se suma a la singularidad de las proteínas ARF, porque la mayoría de las proteínas eucariotas están acetiladas en el extremo N , impidiendo la ubiquinación en esta ubicación. Los penúltimos residuos afectan la eficiencia de la acetilación, ya que la acetilación es promovida por residuos ácidos e inhibida por los básicos. Las secuencias de aminoácidos N-terminales de p19 Arf (Met-Gly-Arg) y p14 ARF (Met-Val-Arg) serían procesadas por la metionina aminopeptidasa pero no serían acetiladas, lo que permitiría que continuara la ubiquinación. La secuencia de smARF, sin embargo, predice que la metionina iniciadora no sería escindida por la metionina aminopeptidasa y probablemente sería acetilada, por lo que el proteasoma la degradaría sin ubiquinación. [1]
La ARF nucleolar de longitud completa parece estabilizarse mediante NPM. El complejo NPM-ARF no bloquea el extremo N de ARF, pero probablemente protege a ARF del acceso de maquinaria de degradación. [4] La proteína p32 de la matriz mitocondrial estabiliza smARF. [16] Esta proteína se une a varias proteínas celulares y virales, pero se desconoce su función exacta. Derribar p32 disminuye drásticamente los niveles de smARF al aumentar su rotación. Los niveles de p19 Arf no se ven afectados por la caída de p32, por lo que p32 estabiliza específicamente smARF, posiblemente protegiéndolo del proteosoma o de las proteasas mitocondriales . [dieciséis]
Zhang, Y., Y. Xiong y WG Yarbrough. ARF promueve la degradación de MDM2 y estabiliza p53: la eliminación del locus ARF-INK4a altera las vías de supresión tumoral de Rb y p53. Cell 1998, 92(6):725-34.