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Péptido de hibridación de colágeno

Esquema de una hebra de CHP (marcada con una etiqueta "X") que se hibrida con cadenas de colágeno desnaturalizadas y forma una triple hélice de colágeno. Durante la progresión de la enfermedad, el desarrollo de los tejidos o el envejecimiento, las proteasas colagenolíticas pueden degradar ampliamente el colágeno, lo que hace que su triple hélice se despliegue a la temperatura fisiológica debido a la reducción de la estabilidad térmica. X puede representar una biotina o una etiqueta fluorescente.

Un péptido de hibridación de colágeno ( CHP ) es una secuencia peptídica sintética con típicamente de 6 a 10 unidades repetidas del triplete de aminoácidos Gly-Xaa-Yaa , que imita la secuencia característica de los colágenos naturales . [1] [2] Un péptido CHP generalmente posee un alto contenido de prolina e hidroxiprolina en las posiciones Xaa y Yaa, lo que le confiere una fuerte propensión a formar la conformación de triple hélice única del colágeno . [1] [3] En el estado monocatenario (monomérico), el péptido puede reconocer hebras de colágeno desnaturalizadas en los tejidos formando una triple hélice hibridada con las hebras de colágeno. [2] Esto ocurre a través del ensamblaje de la cadena de triple hélice y los enlaces de hidrógeno entre cadenas, de una manera similar a la unión de los cebadores a las cadenas de ADN derretidas durante la PCR . [4] La unión no depende de una secuencia o epítopo específico del colágeno, lo que permite a los CHP apuntar a cadenas de colágeno desnaturalizadas de diferentes tipos. [5] [6]

Colágeno, CHP, CMP y CLP

Esquema que muestra la relación entre CMP y CHP. Los CMP de triple hélice se pueden calentar (por encima de una temperatura definida) para disociarse en CHP monoméricos; Al enfriarse, las hebras de CHP pueden volver a ensamblarse en una triple hélice con el tiempo.

El colágeno es el componente principal de la matriz extracelular (MEC). [7] La ​​superfamilia del colágeno consta de 28 tipos diferentes de colágeno. [7] Aunque la función y la estructura jerárquica de estos colágenos pueden variar, todos comparten la característica estructural definitoria conocida como triple hélice, [1] donde tres hélices izquierdas de poliprolina II (PPII) se ensamblan para formar una hélice derecha. motivo helicoidal superenrollado. [1] [8] Los péptidos sintéticos cortos conocidos como péptidos miméticos de colágeno (CMP) o péptidos similares al colágeno (CLP) han desempeñado un papel importante en el esclarecimiento de la estructura tridimensional de la triple hélice del colágeno , su cinética de plegado y su estabilidad térmica en pequeñas cantidades. Modelos de triple hélice. [3] [9] [10] [11] Las CMP, CLP y CHP son muy similares en términos de sus secuencias de aminoácidos, pero sólo cuando las CMP o CLP se calientan por encima de sus temperaturas de fusión existen en forma disociada y única. -estado varado y pueden considerarse CHP. [2]

Mecanismo de encuadernación

Los CHP monocatenarios se unen a cadenas de colágeno desnaturalizadas y a gelatina de una manera que es única respecto a otros mecanismos de focalización, en el sentido de que reconocen específicamente un motivo estructural único ( triple hélice de colágeno ) para el plegamiento y el ensamblaje de la cadena, a diferencia de la unión de epítopos específicos que es común. observado para los anticuerpos monoclonales (mAb), por ejemplo. [12] Debido a su mecanismo de direccionamiento único, los CHP tienen una alta especificidad de unión hacia las cadenas de colágeno desnaturalizadas, pero casi no tienen afinidad por el colágeno intacto (triple hélice). [13] Los CHP pueden atacar ampliamente cadenas de colágeno que han sido desnaturalizadas por procesos térmicos, [13] químicos, [14] mecánicos, [15] o enzimáticos, [13] así como múltiples tipos de colágeno (p. ej., Col I , II , IV ). [5] [6] Los estudios también demostraron que los CHP y sus conjugados de fluoróforo tienen una estabilidad superior en contacto con el suero. [dieciséis]

Colágeno desnaturalizado como biomarcador de remodelación y daño tisular.

Una imagen de fluorescencia de una sección transversal axial de un corazón de ratón el día 14 después del infarto de miocardio, teñida con Hoechst 33342 (azul) y CHP marcado con biotina (detectado con AlexaFluor647-estreptavidina, rojo). Barra de escala: 1 mm.

El recambio controlado de colágeno es crucial para el desarrollo embrionario, la morfogénesis de los órganos, así como para el mantenimiento y reparación de los tejidos. [17] Sin embargo, los cambios en la homeostasis del colágeno están asociados con numerosas enfermedades y condiciones patológicas. La degradación excesiva del colágeno puede estar asociada con metástasis de cáncer , envejecimiento de la piel , artritis y osteoporosis . [17] Los CHP pueden apuntar a tejidos que están experimentando remodelación en función de su capacidad para unirse a hebras de colágeno degradadas y desplegadas mediante la formación de triple hélice. Como grupo objetivo, los CHP ofrecen un gran potencial en histopatología , diagnóstico y administración de fármacos para una amplia gama de enfermedades.

La mayoría de los métodos para la evaluación de la desnaturalización del colágeno en estados patológicos son indirectos, como la detección de la actividad de la metaloproteinasa de la matriz (MMP) o la cuantificación de fragmentos de péptidos de colágeno en orina, suero o líquido sinovial . [18] [19] [20] Al utilizar métodos convencionales para atacar directamente el colágeno, los investigadores deben confiar en péptidos de unión a colágeno seleccionados mediante presentación en fagos , [21] derivados de proteínas de unión a colágeno, [22] o anticuerpos generados contra los colágenos. Desafortunadamente, estos compuestos no pueden apuntar a colágenos desnaturalizados que no están estructurados y no presentan un epítopo 3D definido. Además, los anticuerpos que, según se informó, distinguían fragmentos de colágeno degradados específicos solo pueden reconocer uno o unos pocos tipos de colágeno. [2] [23] Por el contrario, los CHP, en principio, pueden unirse a todo tipo de colágenos desnaturalizados. [4] [5] [6]

Aplicaciones

Tinción de tejidos

Una imagen de fluorescencia de una sección sagital de un embrión de ratón de 18 dpc teñido doblemente con CHP biotinilado (detectado por AlexaFluor647-estreptavidina, naranja) y un anticuerpo anticolágeno I (detectado por IgG H&L anti-conejo de burro marcado con AlexaFluor555, cian) . mx, maxilar; md, hueso mandibular; pb, hueso basefenoideo; bo, hueso basioccipital; vc, columna vertebral; rb, costilla; h, hueso de la cadera; d, huesos digitales. Barra de escala: 3 mm.

Los CHP marcados con fluoróforo o biotina se utilizan como agente de tinción para detectar la degradación y desnaturalización del colágeno mediante aplicaciones de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica . [5] Los CHP pueden teñir secciones de tejido congelado , secciones embebidas en parafina fijadas con formalina (FFPE), [5] así como tejidos frescos. [14] [15] CHP es aplicable a muestras de tejido de múltiples especies y una variedad de enfermedades, como infarto de miocardio , artritis , nefritis y fibrosis . [5]

Imágenes in vivo

Los CHP también se pueden marcar con fluoróforos del infrarrojo cercano para obtener imágenes fluorescentes in vivo . [13] [24]

Identificación de colágeno

Los CHP se pueden utilizar para visualizar muchos tipos diferentes de bandas de colágeno en geles SDS-PAGE . [6] El colágeno se desnaturaliza calentándolo en presencia de SDS antes de cargar el gel. Las bandas de colágeno se visualizan mediante hibridación CHP-colágeno cuando los geles se tiñen con CHP marcados con fluorescencia. [6]

Detección de daños mecánicos al tejido conectivo.

El colágeno ofrece resistencia mecánica en los tejidos que soportan carga en el cuerpo, como tendones, ligamentos y huesos. A medida que se aplican fuerzas a estos tejidos, la triple hélice de colágeno puede dañarse y desenrollarse, y los CHP permiten la detección a nivel molecular del daño mecánico en dichos tejidos conectivos. [15] [25]

Referencias

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