Una etiqueta de polihistidina , más conocida por el nombre de marca registrada His-tag , es un motivo de aminoácido en las proteínas que normalmente consta de al menos seis residuos de histidina ( His ), a menudo en el extremo N o C de la proteína. También se conoce como etiqueta hexahistidina , etiqueta 6xHis o etiqueta His6 . La etiqueta fue inventada por Roche , [1] aunque el uso de histidinas y sus vectores son distribuidos por Qiagen . Varias empresas ofrecen comercialmente varios kits de purificación para proteínas marcadas con histidina. [2]
El número total de residuos de histidina puede variar en la etiqueta desde tan solo dos hasta 10 o más residuos de His. Las etiquetas His N- o C-terminales también pueden ir seguidas o precedidas, respectivamente, por una secuencia de aminoácidos adecuada que facilite la eliminación de la etiqueta de polihistidina usando endopeptidasas . Esta secuencia adicional no es necesaria si se utilizan exopeptidasas para eliminar etiquetas His N-terminales (p. ej., Qiagen TAGZyme). Además, la escisión de exopeptidasa puede resolver la escisión inespecífica observada cuando se utiliza la eliminación de etiquetas basada en endoproteasa. Las etiquetas de polihistidina se utilizan a menudo para la purificación por afinidad de proteínas modificadas genéticamente .
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Las proteínas pueden coordinar los iones metálicos en su superficie y es posible separarlas mediante cromatografía aprovechando la diferencia en su afinidad por los iones metálicos. Esto se denomina cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC), como se introdujo originalmente en 1975 con el nombre de cromatografía de afinidad de quelatos metálicos. [3] Estudios posteriores han revelado que entre los aminoácidos que constituyen las proteínas, la histidina participa fuertemente en el complejo de coordinación con iones metálicos. [4] Por lo tanto, si se añaden varias histidinas al final de la proteína, la afinidad de la proteína por el ion metálico aumenta y esto puede aprovecharse para aislar selectivamente la proteína de interés. Cuando una proteína con una etiqueta His se pone en contacto con un portador en el que está inmovilizado un ion metálico como el níquel, el residuo de histidina quela el ion metálico y se une al portador. Dado que otras proteínas no se unen al soporte o se unen sólo muy débilmente, se pueden eliminar lavando el soporte con un tampón apropiado. La proteína marcada con polihistidina puede recuperarse eluyéndola de la resina. [5]
Las etiquetas de polihistidina suelen consistir en seis residuos de histidina. Sin embargo, las etiquetas con hasta doce residuos de histidina o etiquetas duales unidas mediante un conector corto no son infrecuentes y pueden mejorar los resultados de la purificación al mejorar la unión a la resina de afinidad, lo que permite una mayor rigurosidad del lavado y la separación de las proteínas endógenas. [6] [7] [8] La etiqueta se puede agregar a un gen de interés utilizando métodos comunes a la mayoría de las etiquetas de purificación . El método más básico consiste en subclonar el gen de interés en un vector que contiene una secuencia marcadora de polihistidina. Muchos vectores para uso con diversos sistemas de expresión están disponibles con etiquetas de polihistidina en una variedad de posiciones y con diferentes sitios de escisión de proteasa, otras etiquetas , etc. [9] Sin embargo, si no se dispone de un vector apropiado o es necesario insertar la etiqueta en una ubicación distinta de las proteínas N- o C-terminales, el gen de interés se puede sintetizar directamente conteniendo una secuencia de etiqueta de polihistidina o varios métodos basados en PCR se puede utilizar para agregar la etiqueta a un gen. Un enfoque común es agregar la secuencia codificante de la etiqueta de polihistidina a los cebadores de PCR como un saliente. [10] [11]
Más comúnmente, una etiqueta de polihistidina se fusiona en el extremo N o C de una proteína y se une mediante un conector corto y flexible, que puede contener un sitio de escisión de proteasa. [10] [9] Con menos frecuencia, las etiquetas se pueden agregar en los extremos N y C o insertarse en una parte intermedia de una proteína, como dentro de un bucle expuesto. [12] [8] La elección de la posición de la etiqueta depende de las propiedades de cada proteína y de la estrategia de purificación elegida; Puede que sea necesario probar varias construcciones con la etiqueta en diferentes posiciones. [6] [10] Aunque se considera que las etiquetas de polihistidina normalmente no alteran las propiedades de una proteína, se ha demostrado que la adición de la etiqueta puede causar efectos no deseados, como influir en el estado oligomérico de la proteína. [13]
Se encuentran en el mercado diversas matrices portadoras unidas a un soporte de resina sólida que pueden cargarse posteriormente con un catión metálico. Los derivados del ácido iminodiacético (IDA) y del ácido nitrilotriacético (NTA) se utilizan con mayor frecuencia para este fin, teniendo diferentes matrices ciertas ventajas y desventajas para diversas aplicaciones. [14]
Varios cationes metálicos tienen altas afinidades por el imidazol, el grupo funcional de la etiqueta His. Los complejos de imidazol de metales de transición de cationes divalentes M 2+ (M = Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zi , etc. ) se utilizan con mayor frecuencia para este propósito. La elección del catión es generalmente un compromiso entre capacidad de unión y pureza. Se suele utilizar níquel ya que ofrece un buen equilibrio entre estos factores, mientras que el cobalto se puede utilizar cuando se desea aumentar la pureza de la purificación ya que tiene menos afinidad por las proteínas endógenas; Sin embargo, la capacidad de unión es menor en comparación con el níquel. [14] [10]
Para eluir la proteína marcada con His del portador, existen varios métodos potenciales, que pueden usarse en combinación si es necesario. Para evitar la desnaturalización de las proteínas, generalmente es deseable utilizar un método lo más suave posible.
Para liberar la proteína marcada con His del soporte se utiliza un compuesto que tiene una estructura similar a la etiqueta His y que también forma un complejo de coordinación con los iones metálicos inmovilizados. Un compuesto de este tipo añadido a la proteína marcada con His en el portador compite con la proteína por los iones metálicos inmovilizados. El compuesto añadido en alta concentración reemplaza prácticamente toda la proteína unida al portador que así se eluye del portador. El imidazol es la cadena lateral de la histidina y normalmente se utiliza en una concentración de 150 a 500 mM para la elución. También se puede utilizar histidina o histamina.
Cuando el pH disminuye, el residuo de histidina se protona y ya no puede coordinar la etiqueta metálica, lo que permite la elución de la proteína. Cuando se utiliza níquel como ion metálico, se eluye a un pH aproximado de 4 y el cobalto a un pH aproximado de 6.
Cuando se agrega un agente quelante fuerte como EDTA, la proteína se desprende del portador porque se pierde el ión metálico inmovilizado en el portador.
Las etiquetas de polihistidina se utilizan a menudo para la purificación por afinidad de proteínas recombinantes marcadas con polihistidina expresadas en Escherichia coli u otros sistemas de expresión. Normalmente, las células se recolectan mediante centrifugación y el sedimento celular resultante se lisa por medios físicos o por medio de detergentes y enzimas como lisozima o cualquier combinación de estos. En esta etapa, el lisado contiene la proteína recombinante entre muchas proteínas endógenas que se originan en las células huésped. El lisado se expone a una resina de afinidad unida a una matriz portadora acoplada con un catión divalente, ya sea mediante adición directa de resina (unión por lotes) o pasándolo sobre un lecho de resina en formato de columna. Luego, la resina se lava con tampón para eliminar las proteínas que no interactúan específicamente con el catión unido y la proteína de interés se eluye de la resina utilizando un tampón que contiene una alta concentración de imidazol o un pH reducido. La pureza y la cantidad de proteína se pueden evaluar mediante métodos como SDS-PAGE y transferencia Western . [14] [10] [15]
La purificación por afinidad utilizando una etiqueta de polihistidina normalmente da como resultado una proteína relativamente pura. La pureza de la proteína se puede mejorar mediante la adición de una concentración baja (20-40 mM) de imidazol a los tampones de unión y/o lavado. Sin embargo, dependiendo de los requisitos de la aplicación posterior, es posible que se requieran pasos de purificación adicionales utilizando métodos como el intercambio iónico o la cromatografía de exclusión por tamaño . Las resinas IMAC suelen retener varias proteínas endógenas prominentes como impurezas. En E. coli , por ejemplo, un ejemplo destacado es la peptidil prolil isomerasa de tipo FKBP, que aparece alrededor de 25 kDa en SDS-PAGE . Estas impurezas se pueden eliminar mediante pasos de purificación adicionales o expresando la proteína recombinante en una cepa deficiente de células. Alternativamente, se pueden usar resinas IMAC cargadas de cobalto que tienen menos afinidad por las proteínas endógenas. [16] [10] [14] [17]
El etiquetado con polihistidina se puede utilizar para detectar interacciones proteína-proteína de la misma manera que un ensayo desplegable . El etiquetado con polihistidina tiene varias ventajas sobre otras etiquetas comúnmente utilizadas para ensayos desplegables, incluido su pequeño tamaño, pocas proteínas naturales que se unen a las matrices portadoras y la mayor estabilidad de la matriz portadora sobre las matrices de anticuerpos monoclonales. [18]
Se han desarrollado etiquetas CyDye de hexahistadina, que utilizan la coordinación covalente de níquel con grupos EDTA unidos a fluoróforos para crear tintes que se adhieren a la etiqueta de polihistidina. Se ha demostrado que esta técnica es útil para seguir la migración y el tráfico de proteínas y puede ser eficaz para medir distancias mediante la transferencia de energía por resonancia de Förster . [19]
Se ha informado que una etiqueta de polifluorohistidina se utiliza en sistemas de traducción in vitro . [20] En este sistema, se utiliza un código genético ampliado en el que la histidina se reemplaza por 4-fluorohistidina. El análogo fluorado se incorpora a los péptidos a través de la especificidad de sustrato relajada de la histidina-ARNt ligasa y reduce la pKa general de la etiqueta. Esto permite el enriquecimiento selectivo de péptidos etiquetados con polifluorohistidina en presencia de mezclas complejas de etiquetas de polihistidina tradicionales alterando el pH de los tampones de lavado. [ cita necesaria ]
La etiqueta de polihistidina también se puede utilizar para detectar una proteína mediante anticuerpos anti-etiqueta de polihistidina , que pueden ser útiles para la localización subcelular , ELISA , transferencia Western y otros métodos inmunoanalíticos. Alternativamente, se puede utilizar la tinción en gel de SDS-PAGE o geles de PAGE nativa con sondas fluorescentes que contienen iones metálicos para la detección de una proteína marcada con polihistidina. [21]
La etiqueta HQ alterna histidina y glutamina (HQHQHQ).
La etiqueta HN alterna histidina y asparagina (HNHNHNHNHNHN) y es más probable que se presente en la superficie de la proteína que las etiquetas que solo contienen histidina. La etiqueta HN se une al ion metálico inmovilizado de manera más eficiente que la etiqueta His. [22]
La etiqueta HAT es una etiqueta peptídica (KDHLIHNVHKEEHAHAHNK) derivada de la lactato deshidrogenasa de pollo y es más probable que sea una proteína soluble sin sesgo en la distribución de carga en comparación con la etiqueta His. [23] La disposición de las histidinas en la etiqueta HAT permite una alta accesibilidad en comparación con la etiqueta His y se une eficientemente al ion metálico inmovilizado.