Los oligonucleótidos son moléculas cortas de ADN o ARN , oligómeros , que tienen una amplia gama de aplicaciones en pruebas genéticas , investigación y ciencia forense . Comúnmente fabricados en el laboratorio mediante síntesis química en fase sólida , [1] estos pequeños fragmentos de ácidos nucleicos se pueden fabricar como moléculas monocatenarias con cualquier secuencia especificada por el usuario, y por eso son vitales para la síntesis artificial de genes , la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la secuenciación de ADN , la clonación molecular y como sondas moleculares . En la naturaleza, los oligonucleótidos se encuentran generalmente como pequeñas moléculas de ARN que funcionan en la regulación de la expresión genética (por ejemplo, microARN ), [2] o son intermediarios de degradación derivados de la descomposición de moléculas de ácido nucleico más grandes.
Los oligonucleótidos se caracterizan por la secuencia de residuos de nucleótidos que componen la molécula completa. La longitud del oligonucleótido se denota generalmente por " -mero " (del griego meros , "parte"). Por ejemplo, un oligonucleótido de seis nucleótidos (nt) es un hexámero, mientras que uno de 25 nt normalmente se llamaría "25-mero". Los oligonucleótidos se unen fácilmente, de manera específica de secuencia, a sus respectivos oligonucleótidos complementarios , ADN o ARN para formar dúplex o, con menor frecuencia, híbridos de un orden superior. Esta propiedad básica sirve como base para el uso de oligonucleótidos como sondas para detectar secuencias específicas de ADN o ARN. Los ejemplos de procedimientos que utilizan oligonucleótidos incluyen microarrays de ADN , Southern blots , análisis ASO , [3] hibridación in situ fluorescente (FISH), PCR y la síntesis de genes artificiales.
Los oligonucleótidos están compuestos por 2'-desoxirribonucleótidos (oligodesoxirribonucleótidos), que pueden ser modificados en la cadena principal o en la posición 2' del azúcar para lograr diferentes efectos farmacológicos. Estas modificaciones otorgan nuevas propiedades a los oligonucleótidos y los convierten en un elemento clave en la terapia antisentido . [4] [5]
Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente utilizando bloques de construcción, fosforamiditas protegidas de nucleósidos naturales o modificados químicamente o, en menor medida, de compuestos no nucleosídicos. El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos se realiza en la dirección 3' a 5' siguiendo un procedimiento rutinario denominado "ciclo sintético". La finalización de un solo ciclo sintético da como resultado la adición de un residuo de nucleótido a la cadena en crecimiento. Un rendimiento inferior al 100% de cada paso sintético y la aparición de reacciones secundarias establecen límites prácticos de la eficiencia del proceso. En general, las secuencias de oligonucleótidos suelen ser cortas (13-25 nucleótidos de longitud). [6] La longitud máxima de los oligonucleótidos sintéticos apenas supera los 200 residuos de nucleótidos. Se pueden utilizar HPLC y otros métodos para aislar productos con la secuencia deseada. [ cita requerida ]
La creación de oligonucleótidos cortos químicamente estables fue el primer desafío en el desarrollo de terapias ASO. Los oligonucleótidos naturales se degradan fácilmente por nucleasas, una enzima que escinde nucleótidos y que se encuentra en abundancia en todos los tipos de células. [7] Las secuencias de oligonucleótidos cortos también tienen afinidades de unión intrínsecas débiles, lo que contribuye a su degradación in vivo. [8]
Los análogos de nucleótidos de organotiofosfato de nucleósido (PS) confieren a los oligonucleótidos algunas propiedades beneficiosas. Las principales propiedades beneficiosas que las cadenas principales de PS confieren a los nucleótidos son la identificación de diastereómeros de cada nucleótido y la capacidad de seguir fácilmente las reacciones que involucran a los nucleótidos fosforotioato, lo que es útil en la síntesis de oligonucleótidos. [9] Las modificaciones de la cadena principal de PS a los oligonucleótidos los protegen contra la degradación no deseada por enzimas. [10] La modificación de la cadena principal de nucleótidos se utiliza ampliamente porque se puede lograr con relativa facilidad y precisión en la mayoría de los nucleótidos. [9] Se informó que las modificaciones fluorescentes en los extremos 5' y 3' de los oligonucleótidos evalúan las estructuras, la dinámica y las interacciones de los oligonucleótidos con respecto al medio ambiente. [11]
Otra modificación que es útil para aplicaciones médicas de oligonucleótidos son las modificaciones del azúcar 2' . La modificación del azúcar en la posición 2' aumenta la eficacia de los oligonucleótidos al mejorar las capacidades de unión al objetivo de los oligonucleótidos, específicamente en terapias con oligonucleótidos antisentido . [8] También disminuyen la unión a proteínas no específicas, lo que aumenta la precisión de la selección de proteínas específicas. [8] Dos de las modificaciones más utilizadas son 2'-O-metilo y 2'-O-metoxietilo. [8] También se informaron modificaciones fluorescentes en la nucleobase. [11]
Los oligonucleótidos antisentido (ASO) son cadenas simples de ADN o ARN que son complementarias a una secuencia elegida. [6] En el caso del ARN antisentido, impiden la traducción de proteínas de ciertas cadenas de ARN mensajero uniéndose a ellas, en un proceso llamado hibridación . [12] Los oligonucleótidos antisentido se pueden utilizar para dirigirse a un ARN complementario específico (codificante o no codificante ). Si se produce la unión, este híbrido puede degradarse por la enzima ARNasa H. [ 12] La ARNasa H es una enzima que hidroliza el ARN y, cuando se utiliza en una aplicación de oligonucleótidos antisentido, da como resultado una regulación negativa del 80-95% de la expresión del ARNm. [6]
El uso de oligonucleótidos antisentido de Morfolino para la supresión de genes en vertebrados , que ahora es una técnica estándar en biología del desarrollo y se utiliza para estudiar la expresión y función genética alteradas, fue desarrollado por primera vez por Janet Heasman utilizando Xenopus . [13] Los fármacos Morfolino aprobados por la FDA incluyen eteplirsen y golodirsen . Los oligonucleótidos antisentido también se han utilizado para inhibir la replicación del virus de la gripe en líneas celulares. [14] [15]
Las enfermedades neurodegenerativas que son resultado de una única proteína mutante son buenos objetivos para las terapias con oligonucleótidos antisentido debido a su capacidad de dirigirse a y modificar secuencias muy específicas de ARN con alta selectividad. [3] Muchas enfermedades genéticas, incluidas la enfermedad de Huntington , la enfermedad de Alzheimer , la enfermedad de Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), se han relacionado con alteraciones del ADN que dan lugar a secuencias de ARN incorrectas y a proteínas mal traducidas que tienen un efecto fisiológico tóxico. [16]
La captación/internalización celular sigue representando el mayor obstáculo para el éxito de las terapias con oligonucleótidos (ON). Una captación directa, como ocurre con la mayoría de los fármacos de moléculas pequeñas, se ve obstaculizada por la estructura polianiónica y el tamaño molecular de los ON. Los mecanismos exactos de captación y tráfico intracelular hacia el lugar de acción aún no están muy claros. Además, pequeñas diferencias en la estructura/modificación de los ON (vide supra) y la diferencia en el tipo celular conducen a enormes diferencias en la captación. Se cree que la captación celular se produce en diferentes vías después de la adsorción de los ON en la superficie celular. En particular, los estudios muestran que la mayoría de las células de cultivo de tejidos captan fácilmente los ASO (enlace fosforotioato) de forma no productiva, lo que significa que no se observa ningún efecto antisentido. En contraste con eso, la conjugación de ASO con ligandos reconocidos por receptores acoplados a G conduce a una mayor captación productiva. [17] Además de esa clasificación (no productiva vs. productiva), la internalización celular se produce principalmente de una manera dependiente de la energía (endocitosis mediada por receptor), pero no se puede descartar la difusión pasiva independiente de la energía (gimnosis). Después de atravesar la membrana celular, los agentes terapéuticos del ON se encapsulan en endosomas tempranos que se transportan hacia endosomas tardíos que finalmente se fusionan con lisosomas que contienen enzimas degradantes a un pH bajo. [18] Para ejercer su función terapéutica, el ON necesita escapar del endosoma antes de su degradación. Actualmente no existe un método universal para superar los problemas de entrega, captación celular y escape endosómico, pero existen varios enfoques que se adaptan a células específicas y sus receptores. [19]
Una conjugación de terapias ON a una entidad responsable del reconocimiento/captación celular no solo aumenta la captación (vide supra) sino que también se cree que disminuye la complejidad de la captación celular ya que entonces está involucrado principalmente un mecanismo (idealmente conocido). [18] Esto se ha logrado con conjugados de ON de molécula pequeña, por ejemplo, que contienen una N-acetilgalactosamina que se dirige a los receptores de los hepatocitos . [20] Estos conjugados son un excelente ejemplo para obtener una mayor captación celular emparejada con una administración dirigida, ya que los receptores correspondientes se sobreexpresan en las células objetivo, lo que conduce a una terapia dirigida (compárense los conjugados anticuerpo-fármaco que explotan los receptores sobreexpresados en las células cancerosas). [19] Otra entidad ampliamente utilizada y muy investigada para la administración dirigida y el aumento de la captación celular de oligonucleótidos son los anticuerpos .
Las alquilamidas se pueden utilizar como fases estacionarias cromatográficas . [21] Estas fases se han investigado para la separación de oligonucleótidos. [22] La cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa de pares iónicos se utiliza para separar y analizar los oligonucleótidos después de la síntesis automatizada. [23]
Una mezcla de ácido 5-metoxisalicílico y espermina se puede utilizar como matriz para el análisis de oligonucleótidos en espectrometría de masas MALDI . [24] La espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) también es una herramienta poderosa para caracterizar la masa de oligonucleótidos. [25]
Los microarrays de ADN son una aplicación analítica útil de los oligonucleótidos. En comparación con los microarrays de ADNc estándar , los microarrays basados en oligonucleótidos tienen una especificidad más controlada sobre la hibridación y la capacidad de medir la presencia y prevalencia de secuencias poliadeniladas o empalmadas alternativamente. [26] Un subtipo de microarrays de ADN puede describirse como sustratos (nailon, vidrio, etc.) a los que se han unido oligonucleótidos a alta densidad. [27] Hay varias aplicaciones de los microarrays de ADN dentro de las ciencias de la vida. [ cita requerida ]
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