Un oligonucleótido antisentido ( ASO ) es un fragmento corto de ADN sintético complementario a la secuencia de un ADN diana variable. Actúa como sonda para detectar la presencia del objetivo en un ensayo Southern blot o, más comúnmente, en el ensayo dot blot más simple . Es una herramienta común utilizada en pruebas genéticas , investigación forense y biología molecular .
Un ASO es típicamente un oligonucleótido de 15 a 21 bases de nucleótidos de longitud. Está diseñado (y utilizado) de una manera que lo hace específico para una sola versión, o alelo , del ADN que se está probando. [1] La longitud del ASO, de qué cadena se elige y las condiciones por las cuales se une (y se lava) al ADN objetivo, juegan un papel en su especificidad. Estas sondas generalmente se pueden diseñar para detectar una diferencia de tan solo 1 base en la secuencia genética del objetivo, una capacidad básica en el ensayo de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), importante en el análisis de genotipos y el Proyecto Genoma Humano . Para ser detectado después de que se ha unido a su objetivo, el ASO debe estar marcado con una etiqueta radiactiva, enzimática o fluorescente. La tecnología de ensayo de metilación de Illumina aprovecha el ASO para detectar una diferencia de un par de bases (citosina versus timina) para medir la metilación en un sitio CpG específico.
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La enfermedad humana de la anemia de células falciformes es causada por una mutación genética en el codón del sexto aminoácido de la proteína sanguínea beta-hemoglobina . La secuencia normal de ADN GAG codifica el aminoácido glutamato , mientras que la mutación cambia la adenina central por una timina , dando lugar a la secuencia GTG (GUG en el ARNm ). Esta secuencia alterada sustituye una valina en la proteína final, distorsionando su estructura.
Para comprobar la presencia de la mutación en una muestra de ADN, se sintetizaría una sonda ASO que fuera complementaria a la secuencia alterada, [2] aquí denominada "S". Como control, se sintetizaría otra ASO para la secuencia normal "A". Cada ASO es totalmente complementaria a su secuencia diana (y se unirá fuertemente), pero tiene un único desajuste con respecto a su alelo no diana (lo que conduce a una interacción más débil). El primer diagrama muestra cómo la sonda "S" es totalmente complementaria a la diana "S" (arriba), pero está parcialmente desajuste con respecto a la diana "A" (abajo).
Un segmento de los genes de beta-hemoglobina en el ADN de la muestra se amplificaría por PCR y los productos resultantes se aplicarían a membranas de soporte duplicadas como Dot blots . Las cadenas de ADN de la muestra se separan con álcali y cada sonda ASO se aplica a un blot diferente. Después de la hibridación, se utiliza un protocolo de lavado que puede discriminar entre los híbridos totalmente complementarios y los no coincidentes. Los ASO no coincidentes se eliminan de los blots, mientras que los ASO coincidentes (y sus etiquetas) permanecen.
En el segundo diagrama, se han aplicado seis muestras de ADN amplificado a cada uno de los dos blots. La detección de la etiqueta ASO que queda después del lavado permite una lectura directa del genotipo de las muestras, cada una con dos copias del gen de la beta-hemoglobina. Las muestras 1 y 4 sólo tienen el alelo normal "A", mientras que las muestras 3 y 5 tienen tanto el alelo "A" como el "S" (y por tanto son portadoras heterocigotas de esta mutación recesiva ). Las muestras 2 y 6 tienen sólo el alelo "S", y estarían afectadas por la enfermedad. La pequeña cantidad de "hibridación cruzada" mostrada es típica, y se tiene en cuenta en el proceso de interpretación de los resultados finales.
El análisis ASO es sólo uno de los métodos utilizados para detectar polimorfismos genéticos. La secuenciación directa del ADN se utiliza para caracterizar inicialmente la mutación, pero es demasiado laboriosa para la detección de rutina. Un método anterior, el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) no necesitaba conocer el cambio de secuencia de antemano, pero requería que la mutación afectara el sitio de escisión de una enzima de restricción . El ensayo RFLP se adaptó brevemente al uso de sondas de oligonucleótidos , [3] pero esta técnica fue rápidamente suplantada por el análisis ASO del ADN amplificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La técnica de PCR en sí se ha adaptado para detectar polimorfismos, como PCR específica de alelos . Sin embargo, la simplicidad y versatilidad del método combinado PCR/ASO ha llevado a su uso continuo, incluso con etiquetas no radiactivas, y en un formato de "borrón de puntos inverso" donde las sondas ASO se unen a la membrana y el ADN de muestra amplificado se utiliza para la hibridación .
El uso de oligonucleótidos sintéticos como sondas específicas para variaciones de secuencias genéticas fue iniciado por R. Bruce Wallace, quien trabajaba en el Centro Médico Nacional City of Hope en Duarte, California . En 1979, Wallace y sus colaboradores informaron sobre el uso de sondas ASO para detectar variaciones en un virus bacteriano monocatenario [4] , y más tarde aplicaron la técnica a genes humanos clonados. En 1983 [5] y 1985 [2], el laboratorio de Wallace informó sobre la detección de la mutación para la anemia de células falciformes en muestras de ADN genómico completo, aunque esta aplicación se vio obstaculizada por la pequeña cantidad de etiqueta que podía llevar el ASO. [2]
Afortunadamente, la PCR, un método para amplificar en gran medida un segmento específico de ADN, también se informó en 1985. [3] En menos de un año, la PCR se había emparejado con el análisis ASO. [6] Esta combinación resolvió el problema del etiquetado ASO, ya que la cantidad de ADN objetivo podía amplificarse más de un millón de veces. Además, la especificidad del proceso de PCR en sí mismo podía agregarse a la de las sondas ASO, reduciendo en gran medida el problema de la unión espuria del ASO a secuencias no objetivo. La combinación era lo suficientemente específica como para poder usarse en un Dot blot simple , evitando el laborioso e ineficiente método Southern blot .
La ASO-PCR también se puede utilizar para detectar enfermedad residual mínima en cánceres de la sangre como el mieloma múltiple . [7]