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Nucleasa de dedos de zinc

El diagrama esquemático de las ZFN

Las nucleasas de dedos de zinc ( ZFN ) son enzimas de restricción artificiales generadas mediante la fusión de un dominio de unión al ADN de dedos de zinc con un dominio de escisión del ADN . Los dominios de dedos de zinc se pueden diseñar para apuntar a secuencias de ADN deseadas específicas y esto permite que las nucleasas de dedos de zinc se dirijan a secuencias únicas dentro de genomas complejos . Al aprovechar la maquinaria de reparación del ADN endógena, estos reactivos se pueden utilizar para alterar con precisión los genomas de organismos superiores. Junto con CRISPR/Cas9 y TALEN , ZFN es una herramienta destacada en el campo de la edición genómica .

Fue creado inicialmente por el investigador Srinivasan Chandrasegaran .

Dominios

Dominio de unión al ADN

Los dominios de unión al ADN de las ZFN individuales contienen típicamente entre tres y seis repeticiones de dedos de zinc individuales y cada uno puede reconocer entre 9 y 18 pares de bases. Si los dominios de dedos de zinc reconocen perfectamente una secuencia de ADN de 3 pares de bases, pueden generar una matriz de 3 dedos que puede reconocer un sitio diana de 9 pares de bases. Otros procedimientos pueden utilizar módulos de 1 o 2 dedos para generar matrices de dedos de zinc con seis o más dedos de zinc individuales. El principal inconveniente de este procedimiento es que las especificidades de los dedos de zinc individuales pueden superponerse y pueden depender del contexto de los dedos de zinc circundantes y del ADN. Sin métodos que tengan en cuenta esta "dependencia del contexto", el procedimiento de ensamblaje modular estándar a menudo falla. [1]

Se han utilizado numerosos métodos de selección para generar matrices de dedos de zinc capaces de dirigirse a las secuencias deseadas. Los esfuerzos iniciales de selección utilizaron la visualización de fagos para seleccionar proteínas que se unieran a un objetivo de ADN determinado de un gran grupo de matrices de dedos de zinc parcialmente aleatorizadas. Los esfuerzos más recientes han utilizado sistemas de un híbrido de levadura, sistemas de un híbrido y dos híbridos bacterianos y células de mamíferos. Un nuevo método prometedor para seleccionar nuevas matrices de dedos de zinc utiliza un sistema de dos híbridos bacterianos y ha sido denominado "OPEN" por sus creadores. [2] Este sistema combina grupos preseleccionados de dedos de zinc individuales que fueron seleccionados para unirse a un triplete dado y luego utiliza una segunda ronda de selección para obtener matrices de 3 dedos capaces de unirse a una secuencia deseada de 9 pb. Este sistema fue desarrollado por el Consorcio de Dedos de Zinc como una alternativa a las fuentes comerciales de matrices de dedos de zinc diseñadas.

(ver: Quimera de dedos de zinc para obtener más información sobre las técnicas de selección de dedos de zinc)

Dominio de escisión del ADN

Se muestra un par de ZFN, cada una con tres dedos de zinc que se unen al ADN objetivo, que introducen una rotura de doble cadena, en el dominio FokI, representado en amarillo. Posteriormente, se muestra que la rotura de doble cadena se repara mediante una reparación dirigida por homología o una unión de extremos no homólogos . [3]

El dominio de escisión no específico de la endonucleasa de restricción de tipo II FokI se utiliza normalmente como dominio de escisión en las ZFN. [4] Este dominio de escisión debe dimerizarse para escindir el ADN [5] y, por lo tanto, se requiere un par de ZFN para dirigirse a sitios de ADN no palindrómicos. Las ZFN estándar fusionan el dominio de escisión al extremo C de cada dominio de dedo de zinc. Para permitir que los dos dominios de escisión se dimericen y escindan el ADN, las dos ZFN individuales deben unir cadenas opuestas de ADN con sus extremos C separados a cierta distancia. Las secuencias de enlace más utilizadas entre el dominio de dedo de zinc y el dominio de escisión requieren que el borde 5′ de cada sitio de unión esté separado por 5 a 7 pb. [6]

Se han empleado varias técnicas de ingeniería de proteínas diferentes para mejorar tanto la actividad como la especificidad del dominio de nucleasa utilizado en las ZFN. Se ha empleado la evolución dirigida para generar una variante de FokI con una actividad de escisión mejorada que los autores denominaron "Sharkey". [7] También se ha empleado el diseño basado en la estructura para mejorar la especificidad de escisión de FokI modificando la interfaz de dimerización de modo que solo las especies heterodímeras deseadas estén activas. [8] [9] [10] [11]

Aplicaciones

Las nucleasas de dedos de zinc son útiles para manipular los genomas de muchas plantas y animales, incluyendo arabidopsis , [12] [13] tabaco , [14] [15] soja , [16] maíz , [17] Drosophila melanogaster , [18] C. elegans , [19] Platynereis dumerilii , [20] erizo de mar , [ 21 ] gusano de seda, [22] pez cebra , [ 23 ] ranas , [24 ] ratones , [25] ratas, [26] conejos , [ 27 ] cerdos , [28] ganado , [29] y varios tipos de células de mamíferos. [30] Las nucleasas de dedos de zinc también se han utilizado en un modelo de ratón de hemofilia [31] y un ensayo clínico encontró que las células T humanas CD4+ con el gen CCR5 alterado por nucleasas de dedos de zinc eran seguras como un posible tratamiento para el VIH/SIDA . [32] Las ZFN también se utilizan para crear una nueva generación de modelos de enfermedades genéticas llamados modelos de enfermedades humanas isogénicas .

Desactivación de un alelo

Las ZFN se pueden utilizar para desactivar mutaciones dominantes en individuos heterocigotos al producir roturas de doble cadena (DSB) en el ADN (ver Recombinación genética ) en el alelo mutante, que, en ausencia de una plantilla homóloga, se reparará mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ). La NHEJ repara las DSB uniendo los dos extremos y, por lo general, no produce mutaciones, siempre que el corte sea limpio y sin complicaciones. Sin embargo, en algunos casos, la reparación es imperfecta, lo que resulta en la eliminación o inserción de pares de bases, lo que produce un cambio de marco y evita la producción de la proteína dañina. [33] También se pueden utilizar múltiples pares de ZFN para eliminar por completo segmentos grandes de la secuencia genómica. [34] Para monitorear la actividad de edición, una PCR del área objetivo amplifica ambos alelos y, si uno contiene una inserción, eliminación o mutación, da como resultado una burbuja de cadena sencilla heterodúplex que los ensayos de escisión pueden detectar fácilmente. Las ZFN también se han utilizado para modificar alelos causantes de enfermedades en trastornos de repetición de tripletes. Los tractos de repetición CAG/CTG expandidos son la base genética de más de una docena de trastornos neurológicos hereditarios, entre ellos la enfermedad de Huntington, la distrofia miotónica y varias ataxias espinocerebelosas. Se ha demostrado en células humanas que las ZFN pueden dirigir roturas de doble cadena (DSB) a repeticiones CAG y reducir la longitud de la repetición de longitudes patológicas largas a longitudes cortas, menos tóxicas. [35]

Recientemente, un grupo de investigadores ha aplicado con éxito la tecnología ZFN para modificar genéticamente el gen del pigmento gol y el gen ntl en embriones de pez cebra. Se diseñaron motivos de dedos de zinc específicos para reconocer secuencias de ADN distintas. El ARNm que codifica ZFN se inyectó en embriones unicelulares y un alto porcentaje de animales portaba las mutaciones y los fenotipos deseados. Su trabajo de investigación demostró que las ZFN pueden crear de forma específica y eficiente alelos mutantes hereditarios en loci de interés en la línea germinal, y los alelos inducidos por ZFN pueden propagarse en generaciones posteriores.

Otros grupos de investigación han llevado a cabo investigaciones similares en las que se utilizan ZFN para crear mutaciones específicas en embriones de pez cebra. El gen kdr del pez cebra codifica el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular-2. Un grupo de investigadores de Estados Unidos indujo lesiones mutagénicas en este sitio diana utilizando la técnica ZFN. Sugirieron que la técnica ZFN permite la generación directa de una serie de mutantes alélicos específicos; no depende de la existencia de líneas de células madre embrionarias específicas de la especie y es aplicable a otros vertebrados, especialmente a aquellos cuyos embriones están fácilmente disponibles; por último, también es posible lograr knock-ins específicos en el pez cebra, por lo que es posible crear modelos de enfermedades humanas que hasta ahora son inaccesibles.

Edición de alelos

Las ZFN también se utilizan para reescribir la secuencia de un alelo invocando la maquinaria de recombinación homóloga (HR) para reparar la DSB utilizando el fragmento de ADN suministrado como plantilla. La maquinaria de HR busca homología entre el cromosoma dañado y el fragmento extracromosómico y copia la secuencia del fragmento entre los dos extremos rotos del cromosoma, independientemente de si el fragmento contiene la secuencia original. Si el sujeto es homocigoto para el alelo diana, la eficiencia de la técnica se reduce ya que la copia no dañada del alelo puede utilizarse como plantilla para la reparación en lugar del fragmento suministrado.

Terapia génica

El éxito de la terapia génica depende de la inserción eficiente de genes terapéuticos en un sitio cromosómico objetivo apropiado dentro del genoma humano , sin causar daño celular, mutaciones oncogénicas o una respuesta inmune . La construcción de vectores plasmídicos es simple y directa. Los ZFN diseñados a medida que combinan el dominio de escisión no específico (N) de la endonucleasa Fok I con proteínas de dedos de zinc (ZFP) ofrecen una forma general de entregar un DSB específico del sitio al genoma y estimulan la recombinación homóloga local en varios órdenes de magnitud. Esto hace que la corrección genética dirigida o la edición del genoma sea una opción viable en células humanas. Dado que los plásmidos que codifican ZFN podrían usarse para expresar transitoriamente ZFN para dirigir un DSB a un locus genético específico en células humanas, ofrecen una excelente manera de entregar de forma dirigida los genes terapéuticos a un sitio cromosómico preseleccionado. El enfoque basado en plásmidos que codifican ZFN tiene el potencial de sortear todos los problemas asociados con la entrega viral de genes terapéuticos. [36] Es probable que las primeras aplicaciones terapéuticas de las ZFN impliquen una terapia ex vivo utilizando las propias células madre del paciente. Después de editar el genoma de las células madre, las células podrían expandirse en cultivo y reinsertarse en el paciente para producir células diferenciadas con funciones corregidas. Los objetivos iniciales probablemente incluyan las causas de las enfermedades monogénicas, como el gen IL2Rγ y el gen de la β-globina para la corrección génica y el gen CCR5 para la mutagénesis y la incapacitación. [33]

Problemas potenciales

Escote fuera del objetivo

Si los dominios de dedos de zinc no son lo suficientemente específicos para su sitio objetivo o no se dirigen a un sitio único dentro del genoma de interés, puede ocurrir una escisión fuera del objetivo. Dicha escisión fuera del objetivo puede conducir a la producción de suficientes roturas de doble cadena para abrumar la maquinaria de reparación y, como consecuencia, producir reordenamientos cromosómicos y/o muerte celular. Los eventos de escisión fuera del objetivo también pueden promover la integración aleatoria del ADN donante. [33] Se ha demostrado que dos métodos separados disminuyen la escisión fuera del objetivo para ZFN de 3 dedos que se dirigen a dos sitios adyacentes de 9 pares de bases. [37] Otros grupos utilizan ZFN con 4, 5 o 6 dedos de zinc que se dirigen a sitios más largos y presumiblemente más raros y dichas ZFN podrían, en teoría, producir menos actividad fuera del objetivo. Una comparación de un par de ZFN de 3 dedos y un par de ZFN de 4 dedos detectó una escisión fuera del objetivo en células humanas en 31 loci para las ZFN de 3 dedos y en 9 loci para las ZFN de 4 dedos. [38] La secuenciación del genoma completo de C. elegans modificado con un par de ZFN de 5 dedos encontró solo la modificación deseada y una deleción en un sitio "no relacionado con el sitio ZFN", lo que indica que este par de ZFN era capaz de dirigirse a un sitio único en el genoma de C. elegans . [19]

Inmunogenicidad

Como sucede con muchas proteínas extrañas que se introducen en el cuerpo humano, existe el riesgo de que se produzca una respuesta inmunológica contra el agente terapéutico y las células en las que actúa. Sin embargo, dado que la proteína debe expresarse sólo de forma transitoria, el tiempo durante el cual puede desarrollarse una respuesta es breve. [33]

Liu et al. dirigen respectivamente las ZFNickases al locus b-caseína (CSN2) endógeno, estimulan la adición de genes de lisostafina y lisozima humana mediante reparación dirigida por homología y derivan en vacas que secretan lisostafina. [39] [40]

Perspectivas

La capacidad de manipular con precisión los genomas de plantas y animales tiene numerosas aplicaciones en la investigación básica, la agricultura y la terapéutica humana. El uso de ZFN para modificar genes endógenos ha sido tradicionalmente una tarea difícil debido principalmente al desafío de generar dominios de dedos de zinc que se dirijan a la secuencia deseada con suficiente especificidad. Los métodos mejorados de ingeniería de dominios de dedos de zinc y la disponibilidad de ZFN de un proveedor comercial ahora ponen esta tecnología en manos de un número cada vez mayor de investigadores. Varios grupos también están desarrollando otros tipos de nucleasas diseñadas, incluidas las endonucleasas homing diseñadas [41] [42] y las nucleasas basadas en efectores TAL diseñados . [43] [44] Las nucleasas efectoras TAL (TALEN) son particularmente interesantes porque los efectores TAL parecen ser muy simples de diseñar [45] [46] y las TALEN se pueden usar para dirigirse a loci endógenos en células humanas. [47] Pero hasta la fecha, nadie ha informado del aislamiento de líneas celulares clonales u organismos transgénicos utilizando tales reactivos. Se ha probado un tipo de ZFN, conocido como SB-728-T, para su posible aplicación en el tratamiento del VIH. [48]

Nickasas de dedos de zinc

Las nickasas de dedos de zinc (ZFNickases) se crean inactivando la actividad catalítica de un monómero de ZFN en el dímero de ZFN necesario para la escisión de doble cadena. [49] Las ZFNickases demuestran una actividad de mellado específica de la cadena in vitro y, por lo tanto, proporcionan roturas de cadena simple altamente específicas en el ADN. [49] Estas SSB experimentan los mismos mecanismos celulares para el ADN que explotan las ZFN, pero muestran una frecuencia significativamente reducida de reparaciones NHEJ mutagénicas en su sitio de mellado objetivo. Esta reducción proporciona un sesgo para las modificaciones genéticas mediadas por HR. Las ZFNickases pueden inducir HR dirigida en células humanas y de ganado cultivadas, aunque a niveles más bajos que las ZFN correspondientes de las que se derivaron porque las mellas se pueden reparar sin alteración genética. [39] [50] Una limitación importante de las modificaciones genéticas mediadas por ZFN es la competencia entre las vías de reparación NHEJ y HR. Independientemente de la presencia de un constructo donante de ADN, ambos mecanismos de reparación pueden activarse tras los DSB inducidos por las ZFN. Por lo tanto, las ZFNickases son el primer intento plausible de diseñar un método para favorecer el método HR de reparación de ADN en oposición a la reparación NHEJ propensa a errores. Al reducir las reparaciones NHEJ, las ZFNickases pueden reducir el espectro de alteraciones no deseadas fuera del objetivo. La facilidad con la que las ZFNickases pueden derivarse de las ZFN proporciona una gran plataforma para estudios adicionales sobre la optimización de las ZFNickases y posiblemente aumentar sus niveles de HR objetivo mientras aún mantienen su frecuencia NHEJ reducida.

Véase también

Referencias

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