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Nitrogenasa

Las nitrogenasas son enzimas ( EC 1.18.6.1 EC 1.19.6.1) que son producidas por ciertas bacterias , como las cianobacterias (bacterias azul-verdes) y las rizobacterias . Estas enzimas son responsables de la reducción del nitrógeno (N 2 ) a amoníaco (NH 3 ). Las nitrogenasas son la única familia de enzimas que se sabe que catalizan esta reacción, que es un paso en el proceso de fijación de nitrógeno . La fijación de nitrógeno es necesaria para todas las formas de vida, siendo el nitrógeno esencial para la biosíntesis de moléculas ( nucleótidos , aminoácidos ) que crean plantas, animales y otros organismos. Están codificados por los genes Nif u homólogos . Están relacionados con la protoclorofilida reductasa .

Clasificación y estructura

Aunque la formación en equilibrio de amoníaco a partir de hidrógeno y nitrógeno molecular tiene una entalpía de reacción negativa general ( ), la energía de activación es muy alta ( ). [1] La nitrógenoasa actúa como catalizador , reduciendo esta barrera energética de modo que la reacción pueda tener lugar a temperatura ambiente.

Un conjunto habitual consta de dos componentes:

  1. La proteína heterotetramérica MoFe, una nitrogenasa que utiliza los electrones proporcionados para reducir N 2 a NH 3 . En algunos montajes se sustituye por una alternativa homóloga.
  2. La proteína homodimérica Fe-solo , la reductasa que tiene un alto poder reductor y es responsable del suministro de electrones.
Estructura del cofactor FeMo que muestra los sitios de unión a la nitrogenasa (los aminoácidos cys y his).

reductasa

La proteína Fe, la dinitrogenasa reductasa o NifH, es un dímero de subunidades idénticas que contiene un grupo [Fe 4 S 4 ] y tiene una masa de aproximadamente 60-64 kDa. [2] La función de la proteína Fe es transferir electrones de un agente reductor , como la ferredoxina o la flavodoxina, a la proteína nitrogenasa. La transferencia de electrones requiere un aporte de energía química que proviene de la unión e hidrólisis del ATP . La hidrólisis del ATP también provoca un cambio conformacional dentro del complejo de la nitrogenasa, acercando la proteína Fe y la proteína MoFe para facilitar la transferencia de electrones. [3]

Nitrogenasa

La proteína MoFe es un heterotetrámero que consta de dos subunidades α y dos subunidades β, con una masa de aproximadamente 240-250 kDa. [2] La proteína MoFe también contiene dos grupos de hierro y azufre , conocidos como grupos P, ubicados en la interfaz entre las subunidades α y β y dos cofactores FeMo , dentro de las subunidades α. Anteriormente se pensaba que el estado de oxidación del Mo en estas nitrogenasas era Mo (V), pero la evidencia más reciente es para Mo (III). [4] (El molibdeno en otras enzimas generalmente está unido a la molibdopterina como Mo(VI) completamente oxidado).

Los electrones de la proteína Fe ingresan a la proteína MoFe en los grupos P, que luego transfieren los electrones a los cofactores FeMo. Cada cofactor FeMo actúa entonces como un sitio para la fijación de nitrógeno, con unión de N 2 en la cavidad central del cofactor.

Variaciones

La proteína MoFe puede ser reemplazada por nitrogenasas alternativas en ambientes bajos en el cofactor Mo. Se conocen dos tipos de nitrogenasas: el tipo vanadio-hierro (VFe; Vnf ) y el tipo hierro-hierro (FeFe; Anf ). Ambos forman un conjunto de dos subunidades α, dos subunidades β y dos subunidades δ (a veces γ). Las subunidades delta son homólogas entre sí, y las subunidades alfa y beta son homólogas a las que se encuentran en la MoFe nitrogenasa. Los grupos de genes también son homólogos y estas subunidades son intercambiables hasta cierto punto. Todas las nitrogenasas utilizan un grupo central de Fe-S similar y las variaciones se producen en el metal cofactor. [5] [6]

La Anf nitrogenasa en Azotobacter vinelandii está organizada en un operón anfHDGKOR . Este operón todavía requiere algunos de los genes Nif para funcionar. Se ha construido un operón mínimo de 10 genes diseñado que incorpora estos genes esenciales adicionales. [7]

Mecanismo

Nitrogenasa con sitios catalíticos resaltados. Hay dos conjuntos de sitios catalíticos dentro de cada enzima nitrogenasa.
Nitrogenasa con un conjunto de grupos metálicos ampliados. Los electrones viajan desde el grupo Fe-S (amarillo) al grupo P (rojo) y terminan en FeMo-co (naranja).

Mecanismo general

Sitios catalíticos dentro de la nitrogenasa. Los átomos están coloreados por elemento. Arriba: grupo Fe-S Medio: grupo P Abajo: FeMo-co

La nitrogenasa es una enzima responsable de catalizar la fijación de nitrógeno , que es la reducción de nitrógeno (N 2 ) a amoníaco (NH 3 ) y un proceso vital para el mantenimiento de la vida en la Tierra. [8] Hay tres tipos de nitrogenasa que se encuentran en varias bacterias fijadoras de nitrógeno: nitrógenoasa de molibdeno (Mo), nitrógenoasa de vanadio (V) y nitrógenoasa de hierro solo (Fe). [9] La nitrógenoasa de molibdeno, que se puede encontrar en diazótrofos como los rizobios asociados a leguminosas , [10] [11] es la nitrogenasa que se ha estudiado más extensamente y, por lo tanto, es la mejor caracterizada. [9] La nitrógenoasa de vanadio y la nitrógenoasa sólo de hierro se pueden encontrar en especies seleccionadas de Azotobacter como una nitrogenasa alternativa. [10] [12] Las ecuaciones 1 y 2 muestran las reacciones equilibradas de fijación de nitrógeno en la nitrogenasa de molibdeno y la nitrogenasa de vanadio, respectivamente.

Todas las nitrogenasas son sistemas de dos componentes formados por el Componente I (también conocido como dinitrogenasa) y el Componente II (también conocido como dinitrogenasa reductasa). El componente I es una proteína MoFe en la nitrógenoasa de molibdeno, una proteína VFe en la nitrógenoasa de vanadio y una proteína Fe en la nitrógenoasa sólo de hierro. [8] El componente II es una proteína de Fe que contiene el grupo Fe-S, que transfiere electrones al Componente I. [12] El Componente I contiene 2 grupos de metales: el grupo P y el cofactor FeMo (FeMo-co). . Mo se reemplaza por V o Fe en la nitrogenasa de vanadio y la nitrogenasa solo de hierro, respectivamente. [8] [14] Durante la catálisis, los electrones fluyen desde un par de moléculas de ATP dentro del Componente II al grupo Fe-S, al grupo P y finalmente al FeMo-co, donde se lleva a cabo la reducción de N 2 a NH 3 . lugar.

Modelo cinético de Lowe-Thorneley

La reducción de nitrógeno a dos moléculas de amoníaco se lleva a cabo en el FeMo-co del Componente I después de la adición secuencial de equivalentes de protones y electrones del Componente II. [8] Las mediciones de cinética de estado estacionario , enfriamiento por congelación y flujo detenido realizadas en los años 70 y 80 por Lowe, Thorneley y otros proporcionaron una base cinética para este proceso. [15] [16] El modelo cinético de Lowe-Thorneley (LT) se desarrolló a partir de estos experimentos y documenta las ocho transferencias correlacionadas de protones y electrones necesarias a lo largo de la reacción. [8] [15] [16] Cada etapa intermedia se representa como E n donde n = 0–8, correspondiente al número de equivalentes transferidos. Antes de la adición productiva de N 2 es necesaria la transferencia de cuatro equivalentes , aunque también es posible la reacción de E 3 con N 2 . [15] En particular, se ha demostrado que la reducción de nitrógeno requiere 8 equivalentes de protones y electrones en comparación con los 6 equivalentes predichos por la reacción química equilibrada. [17]

Intermedios E 0 a E 4

La caracterización espectroscópica de estos intermediarios ha permitido una mayor comprensión de la reducción de nitrógeno por la nitrogenasa; sin embargo, el mecanismo sigue siendo un área activa de investigación y debate. A continuación se enumeran brevemente los experimentos espectroscópicos para los intermedios antes de la adición de nitrógeno:

E 0 : este es el estado de reposo de la enzima antes de que comience la catálisis. La caracterización EPR muestra que esta especie tiene un espín de 3/2 . [18]

E 1 : el intermediario reducido de un electrón ha quedado atrapado durante el recambio bajo N 2 . La espectroscopia de Mässbauer del intermedio atrapado indica que el FeMo-co tiene un espín entero mayor que 1. [19]

Modelo cinético de Lowe-Thorneley para la reducción de nitrógeno a amoníaco mediante la nitrogenasa.

E 2 : se propone que este intermedio contenga el grupo metálico en su estado de oxidación en reposo con los dos electrones agregados almacenados en un hidruro puente y el protón adicional unido a un átomo de azufre. El aislamiento de este intermedio en enzimas mutadas muestra que el FeMo-co tiene un espín alto y un espín de 3/2 . [20]

E 3 : se propone que este intermedio sea FeMo-co individualmente reducido con un hidruro puente y un protón. [8]

E 4 : denominado intermedio de Jano en honor al dios romano de las transiciones , este intermedio se coloca exactamente después de la mitad de las transferencias de protones y electrones y puede desintegrarse nuevamente a E 0 o continuar con la unión de nitrógeno y finalizar el ciclo catalítico. Se propone que este intermedio contenga FeMo-co en su estado de oxidación en reposo con dos hidruros puente y dos protones unidos por azufre. [8] Este intermedio se observó por primera vez utilizando técnicas de congelación y extinción con una proteína mutada en la que el residuo 70, un aminoácido valina, se reemplaza con isoleucina. [21] Esta modificación evita el acceso del sustrato al FeMo-co. La caracterización EPR de este intermedio aislado muestra una nueva especie con un espín de ½. Los experimentos de ENDOR han proporcionado información sobre la estructura de este intermediario, revelando la presencia de dos hidruros puente. [21] 95 Mo y 57 Fe ENDOR muestran que los hidruros forman un puente entre dos centros de hierro. [22] El criorecocido del intermedio atrapado a -20 °C da como resultado la pérdida sucesiva de dos equivalentes de hidrógeno tras la relajación, lo que demuestra que el intermedio aislado es consistente con el estado E 4 . [8] La desintegración de E 4 a E 2 + H 2 y finalmente a E 0 y 2H 2 ha confirmado la señal EPR asociada con el intermedio E 2 . [8]

Los intermedios anteriores sugieren que el grupo de metales circula entre su estado de oxidación original y un estado individualmente reducido con electrones adicionales almacenados en hidruros. Alternativamente, se ha propuesto que cada paso implica la formación de un hidruro y que el grupo metálico en realidad oscila entre el estado de oxidación original y un estado simplemente oxidado. [8]

Vías distales y alternas para la fijación de N 2

Vías mecanicistas distales versus alternas para la fijación de nitrógeno en la nitrogenasa.

Si bien en general se acepta el mecanismo de fijación de nitrógeno antes del complejo Janus E 4 , actualmente existen dos hipótesis para la vía exacta en la segunda mitad del mecanismo: la vía "distal" y la vía "alterna". [8] [23] [24] En la vía distal, el nitrógeno terminal se hidrogena primero, libera amoníaco y luego se hidrogena el nitrógeno directamente unido al metal. En la vía alterna, se agrega un hidrógeno al nitrógeno terminal, luego se agrega un hidrógeno al nitrógeno directamente unido al metal. Este patrón alterno continúa hasta que se libera amoníaco. [8] [23] [24] Debido a que cada vía favorece un conjunto único de intermediarios, los intentos de determinar qué vía es la correcta generalmente se han centrado en el aislamiento de dichos intermediarios, como el nitrido en la vía distal, [25] y el diazeno e hidracina por la vía alterna. [8] Los intentos de aislar los intermedios en la propia nitrogenasa hasta ahora no han tenido éxito, pero el uso de complejos modelo ha permitido el aislamiento de intermedios que soportan ambos lados dependiendo del centro metálico utilizado. [8] Los estudios con Mo generalmente apuntan hacia una vía distal, mientras que los estudios con Fe generalmente apuntan hacia una vía alterna. [8] [23] [24] [26] [27]

El apoyo específico para la vía distal proviene principalmente del trabajo de Schrock y Chatt, quienes aislaron con éxito el complejo de nitrido utilizando Mo como centro metálico en un complejo modelo. [25] [28] El apoyo específico para la vía alterna proviene de algunos estudios. Se ha demostrado que los grupos de modelos de hierro únicamente reducen catalíticamente el N 2 . [26] [27] También se ha demostrado que los pequeños grupos de tungsteno siguen una vía alterna para la fijación de nitrógeno. [29] La vanadio nitrogenasa libera hidracina, un intermediario específico del mecanismo de alternancia. [8] [30] Sin embargo, la falta de intermediarios caracterizados en la propia enzima nativa significa que ninguna de las vías se ha probado definitivamente. Además, se ha descubierto que los estudios computacionales respaldan ambos lados, dependiendo de si se supone que el sitio de reacción está en Mo (distal) o en Fe (alternante) en el cofactor MoFe. [8] [23] [24]

Mecanismo de unión de MgATP

La unión de MgATP es uno de los eventos centrales que ocurren en el mecanismo empleado por la nitrogenasa. La hidrólisis del grupo fosfato terminal del MgATP proporciona la energía necesaria para transferir electrones de la proteína Fe a la proteína MoFe. [31] Las interacciones de unión entre los grupos fosfato de MgATP y los residuos de aminoácidos de la proteína Fe se comprenden bien al compararlas con enzimas similares, mientras que las interacciones con el resto de la molécula son más difíciles de alcanzar debido a la falta de un cristal de proteína Fe. estructura con MgATP unido (a partir de 1996). [32] Se ha demostrado que tres residuos de proteínas tienen interacciones significativas con los fosfatos. [15] En ausencia de MgATP, existe un puente salino entre el residuo 15, lisina , y el residuo 125, ácido aspártico . [32] Al unirse, este puente salino se interrumpe. La mutagénesis específica de sitio ha demostrado que cuando se sustituye la lisina por una glutamina , la afinidad de la proteína por el MgATP se reduce considerablemente [33] y cuando se sustituye la lisina por una arginina , el MgATP no puede unirse debido a que el puente salino es demasiado fuerte. [34] La necesidad de ácido aspártico específicamente en el sitio 125 se ha demostrado al observar una reactividad alterada tras la mutación de este residuo a ácido glutámico . [35] Se ha demostrado que el residuo 16, serina, se une al MgATP. Se utilizó mutagénesis específica de sitio para demostrar este hecho. [35] Esto ha llevado a un modelo en el que la serina permanece coordinada con el ion Mg 2+ después de la hidrólisis del fosfato para facilitar su asociación con un fosfato diferente de la ahora molécula de ADP. [36] La unión de MgATP también induce cambios conformacionales significativos dentro de la proteína Fe. [15] Se empleó mutagénesis dirigida para crear mutantes en los que se une MgATP pero no induce un cambio conformacional. [37] La ​​comparación de los datos de dispersión de rayos X en los mutantes con los de la proteína de tipo salvaje llevó a la conclusión de que toda la proteína se contrae tras la unión de MgATP, con una disminución en el radio de aproximadamente 2,0 Å. [37]

Otros detalles mecanicos

Muchos aspectos mecanicistas de la catálisis siguen siendo desconocidos. No se ha informado de ningún análisis cristalográfico sobre el sustrato unido a la nitrogenasa.

La nitrógenoasa puede reducir el acetileno, pero es inhibida por el monóxido de carbono, que se une a la enzima y evita así la unión del dinitrógeno. El dinitrógeno previene la unión del acetileno, pero el acetileno no inhibe la unión del dinitrógeno y requiere solo un electrón para la reducción a etileno . [38] Debido a las propiedades oxidativas del oxígeno , la mayoría de las nitrogenasas son inhibidas irreversiblemente por el dioxígeno , que oxida degradativamente los cofactores Fe-S. [ cita necesaria ] Esto requiere mecanismos para que los fijadores de nitrógeno protejan la nitrogenasa del oxígeno in vivo . A pesar de este problema, muchos utilizan el oxígeno como aceptor terminal de electrones para la respiración. [ cita necesaria ] Aunque la capacidad de algunos fijadores de nitrógeno, como Azotobacteraceae , para emplear una nitrogenasa lábil al oxígeno en condiciones aeróbicas se ha atribuido a una alta tasa metabólica , lo que permite la reducción de oxígeno en la membrana celular , se ha cuestionado la eficacia de tal mecanismo. en concentraciones de oxígeno superiores a 70 μM (la concentración ambiental es de 230 μM O 2 ), así como durante limitaciones adicionales de nutrientes. [39]

Reacciones inespecíficas

Además de la reducción de dinitrógeno, las nitrogenasas también reducen protones a dihidrógeno , lo que significa que la nitrogenasa también es una deshidrogenasa . A continuación se muestra una lista de otras reacciones llevadas a cabo por las nitrogenasas: [40] [41]

HC≡CH → H2C = CH2​
norte – =norte + =O → norte 2 + H 2 O
norte=norte=norte – → norte 2 + NH 3
C≡N−→ CH 4 , NH 3 , H 3 C–CH 3 , H 2 C=CH 2 (CH 3 NH 2 )
N≡C–R → RCH3 + NH3
C≡N–R → CH 4 , H 3 C–CH 3 , H 2 C=CH 2 , C 3 H 8 , C 3 H 6 , RNH 2
O=C=S → CO + H 2 S [42] [43]
O=C=O → CO + H2O [ 42 ]
S=C=N – → H 2 S + HCN [43]
O=C=N – → H 2 O + HCN , CO + NH 3 [43]

Además, el dihidrógeno funciona como un inhibidor competitivo , [44] el monóxido de carbono funciona como un inhibidor no competitivo , [40] [41] y el disulfuro de carbono funciona como un inhibidor de equilibrio rápido [42] de la nitrogenasa.

También se ha demostrado que las nitrogenasas de vanadio catalizan la conversión de CO en alcanos mediante una reacción comparable a la síntesis de Fischer-Tropsch .

Organismos que sintetizan la nitrogenasa.

Hay dos tipos de bacterias que sintetizan la nitrogenasa y son necesarias para la fijación de nitrógeno. Estos son:

Similitud con otras proteínas.

Las tres subunidades de la nitrogenasa exhiben una similitud de secuencia significativa con las tres subunidades de la versión independiente de la luz de la protoclorofilida reductasa que realiza la conversión de protoclorofilida en clorofila . Esta proteína está presente en gimnospermas , algas y bacterias fotosintéticas, pero las angiospermas la han perdido durante la evolución. [45]

Por separado, dos de las subunidades de la nitrogenasa (NifD y NifH) tienen homólogos en metanógenos que no fijan nitrógeno, por ejemplo, Methanocaldococcus jannaschii . [46] Poco se sabe acerca de la función de estos genes nif de "clase IV" , [47] aunque se encuentran en muchos metanógenos. En M. jannaschii se sabe que interactúan entre sí y se expresan constitutivamente. [46]

Medición de la actividad nitrogenasa.

Como ocurre con muchos ensayos de actividad enzimática, es posible estimar la actividad de la nitrogenasa midiendo la tasa de conversión del sustrato (N 2 ) en el producto (NH 3 ). Dado que el NH3 participa en otras reacciones en la célula, a menudo es deseable etiquetar el sustrato con 15 N para proporcionar contabilidad o "equilibrio de masa" del sustrato añadido. Un ensayo más común, el ensayo de reducción de acetileno o ARA, estima la actividad de la nitrogenasa aprovechando la capacidad de la enzima para reducir el gas acetileno a gas etileno. Estos gases se cuantifican fácilmente mediante cromatografía de gases. [48] ​​Aunque se utilizó por primera vez en un laboratorio para medir la actividad de la nitrogenasa en extractos de células de Clostridium pasturianum , ARA se ha aplicado a una amplia gama de sistemas de prueba, incluidos estudios de campo donde otras técnicas son difíciles de implementar. Por ejemplo, ARA se utilizó con éxito para demostrar que las bacterias asociadas con las raíces del arroz experimentan ritmos estacionales y diurnos en la actividad de la nitrógenoasa, que aparentemente estaban controlados por la planta. [49]

Desafortunadamente, la conversión de datos de ensayos de nitrogenasa a moles reales de N 2 reducido (particularmente en el caso de ARA) no siempre es sencilla y puede subestimar o sobreestimar la tasa real por diversas razones. Por ejemplo, el H 2 compite con el N 2 pero no con el acetileno por la nitrogenasa (lo que lleva a sobreestimaciones de la nitrógenoasa por ARA). Los ensayos basados ​​en botellas o cámaras pueden producir impactos negativos en los sistemas microbianos como resultado de la contención o alteración del microambiente durante la manipulación, lo que lleva a una subestimación de la nitrogenasa. A pesar de estas debilidades, estos ensayos son muy útiles para evaluar tasas relativas o patrones temporales en la actividad de la nitrogenasa.

Ver también

Referencias

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