La nanoinyección es un proceso que utiliza una lanza microscópica y fuerzas eléctricas para introducir ADN en una célula. Se afirma que es más eficaz que la microinyección porque la lanza utilizada es diez veces más pequeña que una micropipeta y el método no utiliza ningún líquido. El mecanismo nanoinyector se hace funcionar mientras está sumergido en una solución tamponada con pH . A continuación, se aplica una carga eléctrica positiva a la lanza, que acumula ADN con carga negativa en su superficie. A continuación, el mecanismo nanoinyector penetra en las membranas cigóticas y se aplica una carga negativa a la lanza, liberando el ADN acumulado dentro de la célula. La lanza debe mantener una elevación constante tanto al entrar como al salir de la célula. [1]
La nanoinyección da como resultado una viabilidad celular a largo plazo del 92% después del proceso de inyección electroforética con una nanopipeta de 100 nm de diámetro , el diámetro típico de la pipeta de nanoinyección. [2]
Las transfecciones de células individuales se utilizan para transferir virtualmente cualquier tipo de célula de mamífero a otra utilizando una jeringa que crea una entrada para que se libere el ADN. Se utiliza una nanoaguja como vector mecánico para el ADN plasmídico . El método se puede mejorar aún más con la microscopía de fuerza atómica o AFM. Para evitar causar daño permanente a la célula o provocar una fuga celular de líquido intracelular, la AFM es una herramienta de elección, ya que permite un posicionamiento preciso del ADN, lo que permite la penetración de la punta en el citosol , lo que es fundamental para la transferencia viable de ADN a la célula. [3]
Entre las razones para utilizar la nanoinyección se encuentra la inserción de material genético en el genoma de un cigoto. Este método es un paso fundamental para comprender y desarrollar las funciones de los genes.
La nanoinyección también se utiliza para modificar genéticamente animales para ayudar en la investigación del cáncer , la enfermedad de Alzheimer y la diabetes. [2]
La lanza se fabrica utilizando la tecnología de fabricación polyMUMPs. Crea una capa de oro y dos capas estructurales de 2,0 y 1,5 μm de espesor respectivamente. Es un proceso simple, lo que la hace buena como plataforma para crear prototipos de dispositivos MEMS de polisilicio a un bajo costo comercial de fabricación. La lanza tiene un cuerpo sólido y cónico, de 2 μm de espesor, con un ancho de punta de 150 nm. La conicidad está establecida en 7,9°, llegando a un ancho máximo de 11 μm. Dos conexiones eléctricas altamente plegadas proporcionan una ruta eléctrica entre la lanza y dos almohadillas de unión equivalentes, con un cable de oro que conecta una de las almohadillas de unión a un pin del portador de chip de circuito integrado. Luego, el portador se coloca en un enchufe eléctrico hecho a medida. [4]
En caso de fertilización de huevos, la lanza está incorporada a un mecanismo cinemático que consiste en un mecanismo de seis barras de guía paralela de punto de cambio y una suspensión de viga plegada de guía paralela flexible.
La inyección electroforética sigue siendo la forma más común de nanoinyección. Al igual que con los otros métodos, se utiliza una lanza diez veces más pequeña que la de la microinyección. Al preparar la lanza para la inyección, se aplica una carga positiva, que atrae el ADN cargado negativamente hacia su punta. Una vez que la lanza ha alcanzado una profundidad deseada dentro de la célula, la carga se invierte, lo que repele el ADN hacia el interior de la célula. [1] Los voltajes de inyección típicos son de ±20 V, pero pueden ser tan bajos como 50-100 mV.
Se aplica una fuerza manual a un elemento central del dispositivo de inyección, moviendo las lancetas a través de las membranas celulares y hacia el citoplasma o núcleo de las células adheridas. La magnitud de la fuerza se mide utilizando una placa de fuerza en una pequeña cantidad de inyecciones para obtener una estimación de la fuerza manual. La placa de fuerza está dispuesta para medir la fuerza realmente aplicada al chip de inyección (es decir, sin incluir la rigidez del resorte de soporte). Después de mantener la fuerza durante cinco segundos, se libera la fuerza y se retira el dispositivo de inyección de la célula. El protocolo de difusión presentó datos para comparar con otras variaciones en el proceso de inyección. [5]
Mediante la introducción de determinadas partículas en las células, se pueden tratar o incluso curar enfermedades . La terapia génica es posiblemente el campo más común de introducción de material extraño en las células y tiene grandes implicaciones para la curación de enfermedades genéticas humanas.
Por ejemplo, en un experimento reciente, a dos monos daltónicos de nacimiento se les administró un tratamiento de terapia génica. Como resultado de la terapia génica, ambos animales recuperaron su visión del color sin efectos secundarios aparentes. Tradicionalmente, la terapia génica se ha dividido en dos categorías: vectores biológicos (víricos) y enfoques químicos o físicos (no virales). Aunque los vectores virales son actualmente el enfoque más eficaz para introducir ADN en las células, tienen ciertas limitaciones, entre ellas la inmunogenicidad , la toxicidad y una capacidad limitada para transportar ADN. [5]
Un factor decisivo para el éxito de la terapia génica es el desarrollo de sistemas de administración eficientes. Aunque se han logrado avances en la tecnología de transferencia de genes, incluidos los vectores virales y no virales, todavía no se ha construido un sistema de vectores ideal. [6]
La microinyección es la predecesora de la nanoinyección. Todavía se utiliza en la investigación biológica y es útil para examinar células no vivas o en casos en los que la viabilidad celular no es importante. Al utilizar una pipeta de vidrio de 0,5 a 1,0 micrómetros de diámetro, se daña la membrana de la célula al pincharla. A diferencia de la nanoinyección, la microinyección utiliza un líquido lleno de ADN que se introduce en la célula bajo presión. Dependiendo de factores como la habilidad del operador, las tasas de supervivencia de las células que se someten a este procedimiento pueden ser tan altas como el 56% o tan bajas como el 9%. [2]
Existen otros métodos que se dirigen a grupos de células, como la electroporación . Estos métodos no son capaces de dirigirse a células específicas y, por lo tanto, no se pueden utilizar cuando la eficiencia y la viabilidad celular son una preocupación.