NanoSIMS (espectrometría de masas de iones secundarios a nanoescala ) es un instrumento analítico fabricado por CAMECA que funciona según el principio de espectrometría de masas de iones secundarios . [1] El NanoSIMS se utiliza para adquirir mediciones de resolución a nanoescala [2] de la composición elemental e isotópica de una muestra. El NanoSIMS es capaz de crear mapas a nanoescala de distribución elemental o isotópica, adquisición paralela de hasta siete masas, identificación isotópica , alta resolución de masas, sensibilidad de subpartes por millón con resolución espacial de hasta 50 nm. [3]
El diseño original del instrumento NanoSIMS fue concebido por Georges Slodzian en la Universidad de Paris Sud en Francia y en la Office National d'Etudes et de Recherches Aérospatiales. [4] Actualmente existen alrededor de 50 instrumentos NanoSIMS en todo el mundo. [5]
El NanoSIMS utiliza una fuente de iones para producir un haz primario de iones. Estos iones primarios erosionan la superficie de la muestra y producen colisiones atómicas; algunas de estas colisiones resultan en la liberación de partículas de iones secundarios. Estos iones se transmiten a través de un espectrómetro de masas, donde se miden e identifican las masas. [6] El haz de iones primario se traza a través de la superficie de la muestra y se crea un 'mapa' del elemento y la distribución de isótopos contando el número de iones que se originaron en cada píxel con, en el mejor de los casos, una resolución de 50 nanómetros (nm), 10- 50 veces mayor que las SIMS convencionales. [7] [8] Esto se logra colocando la sonda primaria muy cerca de la muestra usando un conjunto de lentes coaxiales. [8] El haz de iones primario impacta la superficie de la muestra a 90°, y los iones secundarios se extraen a través del mismo conjunto de lentes. Esto permite distinguir la composición isotópica de células individuales en el rango de partes por millón (ppm) o partes por mil millones (ppb). El principal inconveniente de esta configuración es que los haces de iones primarios y secundarios deben ser de polaridad opuesta, lo que puede limitar qué elementos se pueden detectar simultáneamente.
NanoSIMS puede detectar diferencias de masa diminutas entre iones con una resolución de M/dM > 5000, donde M es la masa nominal del isótopo y dM es la diferencia de masa entre los isótopos de interés. [9] Las capacidades de alta resolución de masa de NanoSIMS permiten identificar y mapear espacialmente diferentes elementos y sus isótopos en la muestra, incluso si tienen una masa muy cercana. El espectrómetro de masas es capaz de realizar una recolección múltiple, es decir, se pueden detectar simultáneamente hasta 5 (NanoSIMS 50) o 7 (NanoSIMS 50 L) masas, desde hidrógeno hasta uranio, aunque con limitaciones. [6] [8] El número relativamente grande de masas ayuda a eliminar errores de medición, ya que se evitan posibles cambios en las condiciones instrumentales o de la muestra que pueden ocurrir entre ejecuciones. [9]
El haz de iones debe configurarse para detectar iones negativos o positivos, lo que normalmente se completa mediante el uso de un haz de cesio+ u oxígeno-, respectivamente. [10] La alta resolución de masa que se puede lograr es particularmente relevante para aplicaciones biológicas. Por ejemplo, el nitrógeno es uno de los elementos más comunes en los organismos. Sin embargo, debido a la baja afinidad electrónica del átomo de nitrógeno, la producción de iones secundarios es rara. En cambio, se pueden generar y medir moléculas como el CN. Sin embargo, debido a combinaciones de isótopos, como las isobaras 13 C 14 N- y 12 C 15 N-, se generarán pesos moleculares casi idénticos de 27.000 y 27.006 daltons, respectivamente. A diferencia de otras técnicas de imágenes, donde el 13 C 14 N y el 12 C 15 N no se pueden medir de forma independiente debido a masas casi idénticas, NanoSIMS puede distinguir de forma segura las diferencias entre estas moléculas, lo que permite realizar experimentos de adición isotópica. [10]
El espectrómetro de masas del sector magnético provoca una separación física de iones con una relación masa-carga diferente . La separación física de los iones secundarios es causada por la fuerza de Lorentz cuando los iones pasan a través de un campo magnético perpendicular al vector de velocidad de los iones secundarios. La fuerza de Lorentz establece que una partícula experimentará una fuerza.
cuando mantiene una carga q y viaja a través de un campo eléctrico E y un campo magnético B con una velocidad v . Los iones secundarios que abandonan la superficie de la muestra suelen tener una energía cinética de unos pocos electronvoltios (eV), aunque se ha descubierto que una porción bastante pequeña tiene una energía de unos pocos keV. Un campo electrostático captura los iones secundarios que abandonan la superficie de la muestra; Estos iones extraídos luego se transfieren a un espectrómetro de masas. Para lograr mediciones isotópicas precisas , se necesita una alta transmisión y una alta resolución de masa . La alta transmisión se refiere a la baja pérdida de iones secundarios entre la superficie de la muestra y el detector, y la alta resolución de masa se refiere a la capacidad de separar eficientemente los iones secundarios (o moléculas de interés) de otros iones y/o iones de masa similar. Los iones primarios chocarán con la superficie a una frecuencia específica por unidad de superficie. La colisión que se produce hace que los átomos chisporroteen desde la superficie de la muestra, y de estos átomos sólo una pequeña cantidad sufrirá ionización. Estos se convierten en iones secundarios, que luego se detectan tras su transferencia a través del espectrómetro de masas. Cada ion primario genera una cantidad de iones secundarios de un isótopo que llegarán al detector para ser contados. La tasa de conteo está determinada por
donde I ( i M) es la tasa de recuento del isótopo i M del elemento M. La tasa de recuento del isótopo depende de la concentración, X M y de la abundancia isotópica del elemento , denotada Ai . Debido a que el haz de iones primario determina los iones secundarios, Y , que se pulverizan, la densidad del haz de iones primario, d b , que se define como la cantidad de iones por segundo por unidad de superficie, afectará una porción de la superficie. área de la muestra, S , con una distribución uniforme de los iones primarios. De los iones secundarios pulverizados, sólo hay una fracción que será ionizada, Yi . La probabilidad de que cualquier ion se transfiera con éxito del espectrómetro de masas al detector es T. El producto de Yi y T determina la cantidad de isótopos que serán ionizados, así como también detectados, por lo que se considera el rendimiento útil. [11]
La preparación de muestras es uno de los pasos más críticos en el análisis NanoSIMS, particularmente cuando se analizan muestras biológicas. [12] Se deben desarrollar protocolos específicos para experimentos individuales con el fin de preservar mejor no solo la estructura de la muestra sino también la verdadera distribución espacial y la abundancia de moléculas dentro de la muestra. Como el NanoSIMS opera bajo vacío ultra alto , la muestra debe ser compatible con el vacío (es decir, libre de volátiles), plana, lo que reduce las trayectorias de ionización variables, y conductora, lo que se puede lograr mediante recubrimiento por pulverización catódica con Au , Pt o C. Las muestras biológicas, como células o tejidos, se pueden preparar con fijación química o criofijación y se pueden incrustar en una resina antes de cortarlas en rodajas finas (100 nm - 1 μm) y colocarlas en obleas o portaobjetos de silicio para su análisis. [12] La preparación de muestras metalográficas es generalmente mucho más sencilla, pero se requiere un muy buen pulido metalográfico para lograr una superficie plana y libre de rayones. [5]
NanoSIMS puede capturar la variabilidad espacial de mediciones isotópicas y elementales de áreas submicrónicas, granos o inclusiones de muestras geológicas, de ciencia de materiales y biológicas. [13] Este instrumento puede caracterizar materiales nanoestructurados con composición compleja que son candidatos cada vez más importantes para la generación y almacenamiento de energía.
NanoSIMS también ha demostrado ser útil en el estudio de cuestiones cosmoquímicas , donde se pueden analizar muestras de granos individuales, micro o submicrométricos de meteoritos, así como secciones de microtomo preparadas mediante la técnica del haz de iones enfocados (FIB). NanoSIMS se puede combinar con microscopía electrónica de transmisión (TEM) cuando se utilizan secciones de microtomo o FIB. Esta combinación permite realizar estudios mineralógicos e isotópicos correlacionados in situ a una escala submicrométrica.
Es particularmente útil en la investigación de materiales debido a su alta sensibilidad a alta resolución de masa, que permite la obtención de imágenes y la cuantificación de oligoelementos. [14]
Inicialmente desarrollado para investigaciones geoquímicas y relacionadas, NanoSIMS ahora se utiliza en una amplia variedad de campos, incluidas la biología y la microbiología. En la investigación biomédica, [2] NanoSIMS también se conoce como espectrometría de masas de imágenes multiisótopos (MIMS). [15] La resolución de 50 nm permite una resolución sin precedentes de las características celulares y subcelulares (como referencia, el organismo modelo E. coli suele tener entre 1000 y 2000 nm de diámetro). La alta resolución que ofrece permite la medición intracelular de acumulaciones y flujos de moléculas que contienen diversos isótopos estables. [16] NanoSIMS se puede utilizar para culturas puras, coculturas y muestras de comunidades mixtas. [9]
El primer uso de NanoSIMS en biología fue por Peteranderl y Lechene en 2004, quienes utilizaron un prototipo de NanoSIMS para examinar y medir isótopos de carbono y nitrógeno de células eucariotas. Este estudio fue la primera vez que las proporciones de isótopos de carbono y nitrógeno se midieron directamente a escala subcelular en una muestra biológica. [17]
El desarrollo de NanoSIMS para fármacos organometálicos allanó el camino para explorar la distribución de moléculas biológicamente activas a nivel subcelular. Legin et al. [18] combinaron NanoSIMS con microscopía de barrido láser confocal de fluorescencia para caracterizar la distribución subcelular de cisplatino portador de Pt marcado isotópicamente con 15 N en células de cáncer de colon humano. El cisplatino aparece en el núcleo objetivo de las células del cáncer de colon. 15 N y Pt están separados mostrando que el metabolismo subcelular está en la vía de acción. La internalización de la amiodarona en los lisosomas de los macrófagos se ilustra en Jiang et al. [19] Gracias al bajo límite de detección, dos átomos de yodo de 127 I en la molécula de amiodarona permiten obtener imágenes sin etiquetas mediante NanoSIMS. Las imágenes de yodo y fósforo , junto con el trazado de la intensidad de 127 I frente a 31 P , indicaron una relación lineal entre la cantidad de yodo y fosfolípidos. Estos resultados revelan evidencia de fosfolipidosis inducida por amiodarona.
Él y otros. [20] visualizaron la distribución de oligonucleótidos antisentido terapéuticos marcados con bromo (Br-ASO) en algunas variedades de células cultivadas y, sobre todo, en tejidos de ratón (corazón, riñón e hígado) utilizando datos NanoSIMS combinados con microscopía electrónica retrodispersada. Demostraron que los ASO de fosforotioato se asocian con los filopodios y la membrana nuclear interna de las células. También documentaron una heterogeneidad celular y subcelular esencial en la distribución de ASO en los tejidos del ratón. Becquart et al. [21] informan la concentración absoluta de terapias con oligonucleótidos antisentido en hepatocitos humanos. Su método se basó en el trabajo de Thomen et al. [22] donde informaron la concentración absoluta del profármaco L-dopa marcado con 13 C.
El NanoSIMS se ha utilizado en muchas áreas diferentes de la ciencia de materiales. [5] Es capaz de mapear hidrógeno y deuterio a escalas microestructuralmente relevantes, lo cual es importante para los estudios de la fragilización del hidrógeno en metales [23] aunque existen desafíos importantes asociados con la detección precisa de hidrógeno y deuterio. [24]
Otras técnicas de microscopía se utilizan comúnmente junto con NanoSIMS que permiten obtener múltiples tipos de información, como información taxonómica a través de hibridación fluorescente in situ (FISH) [25] o identificación de características fisiológicas o microestructurales adicionales mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). ) o microscopía electrónica de barrido (SEM).
Los métodos tradicionales que se utilizan para etiquetar e identificar características subcelulares de las células, como el etiquetado con inmunooro, también se pueden utilizar con el análisis NanoSIMS. El etiquetado con inmunogold utiliza anticuerpos para atacar proteínas específicas y, posteriormente, marca los anticuerpos con nanopartículas de oro. El instrumento NanoSIMS puede detectar partículas de oro, proporcionando la ubicación de las proteínas marcadas a una resolución de alta escala. Se tomaron imágenes de compuestos que contienen oro o platino utilizados como medicamentos contra el cáncer utilizando NanoSIMS para examinar la distribución subcelular en células de cáncer de mama y de cáncer de colon, respectivamente. [26] En un estudio separado, se estudió la unión anticuerpo-antígeno sin la necesidad de agregar una etiqueta fluorescente al anticuerpo, lo que permitió la localización sin etiquetas y el análisis cuantitativo a alta resolución. [27]
Otra técnica común que se utiliza habitualmente en el análisis NanoSIMS es el sondeo de isótopos estables. Este método implica la introducción de compuestos biológicamente relevantes estables marcados isotópicamente en los organismos para su consumo e integración en la materia orgánica. Cuando se analiza mediante NanoSIMS, la técnica se denomina nanoSIP. [28] NanoSIMS se puede utilizar para detectar qué organismos incorporaron qué moléculas, cuántas de las moléculas marcadas se incorporaron de manera semicuantitativa y en qué parte de la célula se produjo la incorporación. Las técnicas de análisis cuantitativo anteriores con una resolución más baja que NanoSIMS de moléculas estables marcadas isotópicamente se limitaban al material a granel analizado, lo que no permitía obtener información sobre las contribuciones de las células individuales o los compartimentos subcelulares. [29] Además, la eliminación de moléculas extrañas grandes (como anticuerpos o partículas de oro) de la configuración experimental alivia las preocupaciones de que las moléculas marcadas necesarias para otras técnicas de microscopía puedan tener respuestas o propiedades bioquímicas diferentes a las normales.
Esta técnica se puede utilizar para estudiar el intercambio de nutrientes. Se investigó el microbioma intestinal del ratón para determinar qué microbios se alimentaban de compuestos derivados del huésped. Para ello, se suministró a los ratones alimentos enriquecidos con aminoácidos estables marcados isotópicamente y se examinó la biomasa microbiana. [30] NanoSIMS permite examinar las contribuciones metabólicas de microbios individuales. NanoSIMS se utilizó para estudiar y demostrar por primera vez la capacidad de fijación de nitrógeno de las bacterias y arqueas de las profundidades del océano suministrando compuestos que contienen nitrógeno 15 N a muestras de sedimentos. [31] NanoSIMS también se puede utilizar para estimar la tasa de crecimiento de organismos, ya que la cantidad de carbono u otro sustrato acumulado dentro de la célula permite estimar cuánta biomasa se está generando. [32]
El material orgánico contiene naturalmente isótopos estables en diferentes proporciones en el medio ambiente, lo que puede proporcionar información sobre el origen de la fuente de alimento de los organismos. Los diferentes tipos de material orgánico de las fuentes alimenticias tienen diferentes cantidades de isótopos estables, lo que se refleja en la composición del organismo que ingiere estas fuentes alimenticias. [33] Este tipo de análisis se utilizó por primera vez en 2001 junto con FISH para examinar las relaciones sintróficas entre arqueas anaeróbicas oxidantes de metano y bacterias reductoras de sulfato. [34] Es posible que con este método no se puedan detectar isótopos con abundancias naturalmente bajas.
NanoSIMS también se puede utilizar para examinar la composición elemental e isotópica de micropartículas conservadas en el registro de rocas. [7] Los tipos de elementos y las proporciones isotópicas pueden ayudar a determinar si el material es de origen biológico. [9] NanoSIMS se utilizó por primera vez en este campo de la paleobiología en 2005 por Robert et al. [35] En este estudio, se descubrió que los microfósiles contenían elementos de carbono, nitrógeno y azufre dispuestos como "glóbulos" que recordaban las paredes celulares. La proporción medida de carbono y nitrógeno también sirvió como indicador del origen biológico, ya que la roca que rodeaba los fósiles tenía proporciones de C a N muy diferentes. [7]
![{\displaystyle \mathbf {F} =q\left[\mathbf {E} +(\mathbf {v} \times \mathbf {B} )\right]}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/f0139e901d2aa4f20d3deb80a4e6dd56cd3321a6)
