En biología molecular , la mutagénesis es una importante técnica de laboratorio mediante la cual se diseñan deliberadamente mutaciones de ADN para producir bibliotecas de genes mutantes, proteínas, cepas de bacterias u otros organismos modificados genéticamente . Los diversos componentes de un gen, así como sus elementos reguladores y sus productos genéticos, pueden mutarse para que se pueda examinar en detalle el funcionamiento de un locus, proceso o producto genético. La mutación puede producir proteínas mutantes con propiedades interesantes o funciones mejoradas o novedosas que pueden ser de uso comercial. También se pueden producir cepas mutantes que tengan una aplicación práctica o permitan investigar la base molecular de una función celular particular.
En la actualidad existen muchos métodos de mutagénesis. Inicialmente, el tipo de mutaciones inducidas artificialmente en el laboratorio eran completamente aleatorias utilizando mecanismos como la irradiación UV. La mutagénesis aleatoria no puede dirigirse a regiones o secuencias específicas del genoma; sin embargo, con el desarrollo de la mutagénesis dirigida al sitio , se pueden realizar cambios más específicos. Desde 2013, el desarrollo de la tecnología CRISPR /Cas9, basada en un sistema de defensa viral procariota, ha permitido la edición o mutagénesis de un genoma in vivo . [1] La mutagénesis dirigida al sitio ha demostrado ser útil en situaciones en las que la mutagénesis aleatoria no lo es. Otras técnicas de mutagénesis incluyen la mutagénesis combinatoria y la mutagénesis insercional. La mutagénesis que no es aleatoria se puede utilizar para clonar ADN, [2] investigar los efectos de los mutágenos, [3] y diseñar proteínas. [4] También tiene aplicaciones médicas como ayudar a pacientes inmunodeprimidos, la investigación y el tratamiento de enfermedades como el VIH y los cánceres, y la cura de enfermedades como la beta talasemia . [5]
Los primeros métodos de mutagénesis se basaban en métodos que producían mutaciones completamente aleatorias. En estos métodos, las células u organismos se exponen a mutágenos como la radiación UV o sustancias químicas mutagénicas, y luego se seleccionan mutantes con las características deseadas. Hermann Muller descubrió en 1927 que los rayos X pueden causar mutaciones genéticas en las moscas de la fruta [6] y luego utilizó los mutantes que creó para sus estudios en genética [7] . En el caso de Escherichia coli , los mutantes se pueden seleccionar primero mediante exposición a la radiación UV y luego se siembran en un medio de agar. Las colonias formadas se siembran en réplicas , una en un medio rico , otra en un medio mínimo, y luego se pueden identificar los mutantes que tienen requisitos nutricionales específicos por su incapacidad para crecer en el medio mínimo. Se pueden repetir procedimientos similares con otros tipos de células y con diferentes medios para la selección.
Posteriormente se desarrollaron varios métodos para generar mutaciones aleatorias en proteínas específicas con el fin de detectar mutantes con propiedades interesantes o mejoradas. Estos métodos pueden implicar el uso de nucleótidos dopados en la síntesis de oligonucleótidos o la realización de una reacción de PCR en condiciones que favorezcan la incorporación incorrecta de nucleótidos (PCR propensa a errores), por ejemplo, reduciendo la fidelidad de la replicación o utilizando análogos de nucleótidos. [8] Una variación de este método para integrar mutaciones no sesgadas en un gen es la mutagénesis por saturación de secuencia . [9] Los productos de PCR que contienen una o más mutaciones se clonan luego en un vector de expresión y las proteínas mutantes producidas pueden luego caracterizarse.
En estudios con animales, se han utilizado agentes alquilantes como la N -etil- N -nitrosourea (ENU) para generar ratones mutantes. [10] [11] El etil metanosulfonato (EMS) también se utiliza a menudo para generar mutantes animales, vegetales y virales. [12] [13] [14]
En una ley de la Unión Europea (como la Directiva 2001/18), este tipo de mutagénesis puede utilizarse para producir OGM , pero los productos están exentos de regulación: sin etiquetado, sin evaluación. [15]
Antes del desarrollo de las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, todas las mutaciones realizadas eran aleatorias, y los científicos tenían que utilizar la selección para el fenotipo deseado para encontrar la mutación deseada. Las técnicas de mutagénesis aleatoria tienen una ventaja en términos de cuántas mutaciones se pueden producir; sin embargo, mientras que la mutagénesis aleatoria puede producir un cambio en nucleótidos individuales, no ofrece mucho control en cuanto a qué nucleótido se está cambiando. [5] Por lo tanto, muchos investigadores buscan introducir cambios seleccionados en el ADN de una manera precisa y específica del sitio. Los primeros intentos utilizan análogos de nucleótidos y otros productos químicos que se utilizaron por primera vez para generar mutaciones puntuales localizadas . [16] Estos productos químicos incluyen aminopurina , que induce una transición de AT a GC , [17] mientras que nitrosoguanidina , [18] bisulfito , [19] y N 4 -hidroxicitidina pueden inducir una transición de GC a AT. [20] [21] Estas técnicas permiten diseñar mutaciones específicas en una proteína; Sin embargo, no son flexibles con respecto a los tipos de mutantes generados, ni son tan específicos como los métodos posteriores de mutagénesis dirigida y, por lo tanto, tienen cierto grado de aleatoriedad. Otras tecnologías, como la escisión del ADN en sitios específicos del cromosoma, la adición de nuevos nucleótidos y el intercambio de pares de bases, permiten ahora decidir dónde pueden ir las mutaciones. [11] [8]
Las técnicas actuales para la mutación en sitios específicos tienen su origen en la técnica de extensión de cebadores desarrollada en 1978. Estas técnicas suelen implicar el uso de oligonucleótidos mutagénicos prefabricados en una reacción de extensión de cebadores con la ADN polimerasa . Estos métodos permiten la mutación puntual o la deleción o inserción de pequeños tramos de ADN en sitios específicos. Los avances en la metodología han hecho que dicha mutagénesis sea ahora un proceso relativamente simple y eficiente. [3]
Se están desarrollando constantemente métodos de mutagénesis dirigida más nuevos y eficientes. Por ejemplo, una técnica llamada "extracto de clonación de ligación sin fisuras" (o SLiCE, por sus siglas en inglés) permite clonar ciertas secuencias de ADN dentro del genoma y se puede insertar más de un fragmento de ADN en el genoma a la vez. [2]
La mutagénesis dirigida permite investigar el efecto de una mutación específica. Tiene numerosos usos; por ejemplo, se ha utilizado para determinar la susceptibilidad de ciertas especies a sustancias químicas que se utilizan a menudo en los laboratorios. En el experimento se utilizó mutagénesis dirigida para imitar las mutaciones esperadas de la sustancia química específica. La mutación dio como resultado un cambio en aminoácidos específicos y se analizaron los efectos de esta mutación. [3]
El enfoque dirigido al sitio se puede realizar sistemáticamente en técnicas como la mutagénesis por escaneo de alanina , mediante la cual los residuos se mutan sistemáticamente a alanina para identificar residuos importantes para la estructura o función de una proteína. [22] Otro enfoque integral es la mutagénesis de saturación del sitio , donde un codón o un conjunto de codones se pueden sustituir con todos los aminoácidos posibles en las posiciones específicas. [23] [24]
La mutagénesis combinatoria es una técnica de ingeniería de proteínas dirigida al sitio mediante la cual se pueden diseñar simultáneamente múltiples mutantes de una proteína basándose en el análisis de los efectos de mutaciones individuales aditivas. [25] Proporciona un método útil para evaluar el efecto combinatorio de una gran cantidad de mutaciones en la función de la proteína. [26] Se pueden examinar grandes cantidades de mutantes para una característica particular mediante análisis combinatorio. [25] En esta técnica, se pueden modificar exhaustivamente múltiples posiciones o secuencias cortas a lo largo de una cadena de ADN para obtener una biblioteca completa de proteínas mutantes. [25] La tasa de incidencia de variantes beneficiosas se puede mejorar mediante diferentes métodos para construir bibliotecas de mutagénesis. Un enfoque de esta técnica es extraer y reemplazar una parte de la secuencia de ADN con una biblioteca de secuencias que contengan todas las combinaciones posibles en el sitio de mutación deseado. El contenido del segmento insertado puede incluir secuencias de importancia estructural, propiedad inmunogénica o función enzimática. También se puede insertar un segmento aleatoriamente en el gen para evaluar la importancia estructural o funcional de una parte particular de una proteína. [25]
La inserción de uno o más pares de bases, que da lugar a mutaciones del ADN, también se conoce como mutagénesis insercional . [27] Las mutaciones diseñadas como estas pueden proporcionar información importante en la investigación del cáncer, como conocimientos mecanísticos sobre el desarrollo de la enfermedad. Los retrovirus y los transposones son las principales herramientas instrumentales en la mutagénesis insercional. Los retrovirus, como el virus del tumor mamario del ratón y el virus de la leucemia murina, se pueden utilizar para identificar genes implicados en la carcinogénesis y comprender las vías biológicas de cánceres específicos. [28] Los transposones, segmentos cromosómicos que pueden sufrir transposición, se pueden diseñar y aplicar a la mutagénesis insercional como un instrumento para el descubrimiento de genes del cáncer. [28] Estos segmentos cromosómicos permiten que la mutagénesis insercional se aplique a prácticamente cualquier tejido de elección, al tiempo que permiten una profundidad más completa e imparcial en la secuenciación del ADN. [28]
Los investigadores han descubierto cuatro mecanismos de mutagénesis insercional que se pueden utilizar en humanos. El primer mecanismo se denomina inserción de potenciadores. Los potenciadores aumentan la transcripción de un gen en particular al interactuar con un promotor de ese gen. Este mecanismo en particular se utilizó por primera vez para ayudar a pacientes con un sistema inmunitario grave que necesitaban médula ósea. Luego se insertaron en los pacientes gammaretrovirus que portaban potenciadores. El segundo mecanismo se denomina inserción de promotores. Los promotores proporcionan a nuestras células las secuencias específicas necesarias para comenzar la traducción. La inserción de promotores ha ayudado a los investigadores a aprender más sobre el virus del VIH. El tercer mecanismo es la inactivación genética. Un ejemplo de inactivación genética es el uso de mutagénesis insercional para insertar un retrovirus que altera el genoma de la célula T en pacientes con leucemia y darles un antígeno específico llamado CAR que permite que las células T se dirijan a las células cancerosas. El mecanismo final se denomina sustitución del extremo 3' del ARNm. Ocasionalmente, nuestros genes sufren mutaciones puntuales que causan beta-talasemia que interrumpe la función de los glóbulos rojos. Para solucionar este problema, se introduce la secuencia genética correcta para los glóbulos rojos y se realiza una sustitución. [5]
La recombinación homóloga se puede utilizar para producir una mutación específica en un organismo. Se introduce en la célula un vector que contiene una secuencia de ADN similar al gen que se va a modificar y, mediante un proceso de recombinación, reemplaza el gen diana en el cromosoma. Este método se puede utilizar para introducir una mutación o inactivar un gen, por ejemplo, como se utiliza en la producción de ratones inactivados . [29]
Desde 2013, el desarrollo de la tecnología CRISPR -Cas9 ha permitido introducir de forma eficiente distintos tipos de mutaciones en el genoma de una amplia variedad de organismos. El método no requiere un sitio de inserción de transposón, no deja ningún marcador y su eficiencia y simplicidad lo han convertido en el método preferido para la edición genómica . [30] [31]
A medida que el costo de la síntesis de oligonucleótidos de ADN disminuye, la síntesis artificial de un gen completo es ahora un método viable para introducir mutaciones en un gen. Este método permite una mutación extensa en múltiples sitios, incluido el rediseño completo del uso de codones de un gen para optimizarlo para un organismo en particular. [32]