En biología molecular y biotecnología , una etiqueta fluorescente , también conocida como etiqueta fluorescente o sonda fluorescente , es una molécula que se une químicamente para ayudar en la detección de una biomolécula como una proteína, un anticuerpo o un aminoácido. Generalmente, el etiquetado fluorescente , o marcaje, utiliza un derivado reactivo de una molécula fluorescente conocida como fluoróforo . El fluoróforo se une selectivamente a una región específica o grupo funcional en la molécula objetivo y se puede unir química o biológicamente. [1] Se utilizan ampliamente varias técnicas de etiquetado, como el etiquetado enzimático, el etiquetado de proteínas y el etiquetado genético. El bromuro de etidio , la fluoresceína y la proteína fluorescente verde son etiquetas comunes. Las moléculas etiquetadas con más frecuencia son anticuerpos, proteínas, aminoácidos y péptidos que luego se utilizan como sondas específicas para la detección de un objetivo en particular. [2]
El desarrollo de métodos para detectar e identificar biomoléculas ha sido motivado por la capacidad de mejorar el estudio de la estructura y las interacciones moleculares. Antes de la llegada del marcaje fluorescente, se utilizaban radioisótopos para detectar e identificar compuestos moleculares. Desde entonces, se han desarrollado métodos más seguros que implican el uso de colorantes fluorescentes o proteínas fluorescentes como etiquetas o sondas como medio para marcar e identificar biomoléculas. [3] Aunque el marcaje fluorescente en este sentido se ha utilizado recientemente, el descubrimiento de la fluorescencia existe desde hace mucho más tiempo.
En 1852, Sir George Stokes desarrolló la Ley de fluorescencia de Stokes, que establece que la longitud de onda de la emisión de fluorescencia es mayor que la de la radiación excitadora. En 1897, Richard Meyer denominó fluoróforo a un grupo químico asociado con la fluorescencia. Desde entonces, Adolph von Baeyer creó la fluoresceína como colorante fluorescente en 1871 y el método de tinción se desarrolló y utilizó con el desarrollo de la microscopía de fluorescencia en 1911. [4]
El bromuro de etidio y sus variantes se desarrollaron en la década de 1950 [4] y en 1994 se introdujeron las proteínas fluorescentes o FP [5 ]. La proteína fluorescente verde o GFP fue descubierta por Osamu Shimomura en la década de 1960 y fue desarrollada como molécula trazadora por Douglas Prasher en 1987 [6]. Las FP condujeron a un gran avance en la obtención de imágenes de células vivas con la capacidad de etiquetar selectivamente regiones de proteínas genéticas y observar las funciones y mecanismos de las proteínas [5] . Por este avance, Shimomura recibió el Premio Nobel en 2008 [7].
Se han desarrollado nuevos métodos para rastrear biomoléculas, incluido el uso de biosensores colorimétricos, compuestos fotocrómicos, biomateriales y sensores electroquímicos. El etiquetado fluorescente también es un método común cuyas aplicaciones se han ampliado al etiquetado enzimático, el etiquetado químico, el etiquetado de proteínas y el etiquetado genético. [1]
Actualmente existen varios métodos de etiquetado para rastrear biomoléculas. Algunos de ellos son los siguientes:
Las especies comunes para las que se utilizan marcadores isotópicos incluyen proteínas. En este caso, los aminoácidos con isótopos estables de carbono, nitrógeno o hidrógeno se incorporan a secuencias polipeptídicas. [8] Estos polipéptidos se someten luego a espectrometría de masas . Debido al cambio definido exacto que estos isótopos provocan en los péptidos, es posible determinar a través del gráfico espectrométrico qué péptidos contienen los isótopos. Al hacerlo, se puede extraer la proteína de interés de varias otras en un grupo. Los compuestos isotópicos juegan un papel importante como fotocromos, que se describen a continuación.
Los biosensores se adhieren a una sustancia de interés. Normalmente, esta sustancia no sería capaz de absorber la luz, pero con el biosensor adjunto, la luz puede ser absorbida y emitida en un espectrofotómetro . [9] Además, los biosensores que son fluorescentes pueden verse a simple vista. Algunos biosensores fluorescentes también tienen la capacidad de cambiar de color en entornos cambiantes (por ejemplo, de azul a rojo). Un investigador podría inspeccionar y obtener datos sobre el entorno circundante en función del color que pudiera ver visiblemente de la especie híbrida biosensor-molécula. [10]
Los ensayos colorimétricos se utilizan normalmente para determinar cuánta concentración de una especie hay en relación con otra. [9]
Los compuestos fotocromáticos tienen la capacidad de cambiar entre una gama o variedad de colores. Su capacidad para mostrar diferentes colores radica en la forma en que absorben la luz. Las diferentes manifestaciones isoméricas de la molécula absorben diferentes longitudes de onda de luz, de modo que cada especie isomérica puede mostrar un color diferente en función de su absorción. Entre ellos se incluyen los compuestos fotoconmutables, que son proteínas que pueden cambiar de un estado no fluorescente a uno fluorescente en un entorno determinado. [11]
La molécula orgánica más común que se utiliza como fotocromo es el diarileteno . [12] Otros ejemplos de proteínas fotoconmutables incluyen PADRON-C, rs-FastLIME-s y bs-DRONPA-s, que se pueden utilizar en células vegetales y de mamíferos por igual para observar cómo las células se mueven en diferentes entornos. [11]
Los biomateriales fluorescentes son una forma posible de utilizar factores externos para observar una vía de forma más visible. El método implica marcar con fluorescencia moléculas de péptidos que alterarían la vía natural de un organismo. Cuando este péptido se inserta en la célula del organismo, puede inducir una reacción diferente. Este método se puede utilizar, por ejemplo, para tratar a un paciente y luego ver visiblemente el resultado del tratamiento. [13]
Los sensores electroquímicos se pueden utilizar para la detección sin etiquetas de biomoléculas. Detectan cambios y miden la corriente entre un electrodo metálico sondeado y un electrolito que contiene el analito objetivo. Luego se aplica un potencial conocido al electrodo a partir de una corriente de retroalimentación y se puede medir la corriente resultante. Por ejemplo, una técnica que utiliza la detección electroquímica incluye aumentar lentamente el voltaje, lo que hace que las especies químicas en el electrodo se oxiden o reduzcan. Se representa gráficamente la corriente de la celda frente al voltaje, lo que en última instancia puede identificar la cantidad de especies químicas consumidas o producidas en el electrodo. [14] Las etiquetas fluorescentes se pueden utilizar junto con sensores electroquímicos para facilitar la detección en un sistema biológico.
De los diversos métodos de etiquetado de biomoléculas, las etiquetas fluorescentes son ventajosas porque son muy sensibles incluso a baja concentración y no son destructivas para el plegamiento y la función de la molécula objetivo. [1]
La proteína fluorescente verde es una proteína fluorescente natural de la medusa Aequorea victoria que se utiliza ampliamente para etiquetar proteínas de interés. La GFP emite un fotón en la región verde del espectro de luz cuando se excita por la absorción de luz. El cromóforo consiste en un tripéptido oxidado -Ser^65-Tyr^66-Gly^67 ubicado dentro de un barril β. La GFP cataliza la oxidación y solo requiere oxígeno molecular. La GFP se ha modificado cambiando la longitud de onda de la luz absorbida para incluir otros colores de fluorescencia. La YFP o proteína fluorescente amarilla , la BFP o proteína fluorescente azul y la CFP o proteína fluorescente cian son ejemplos de variantes de la GFP. Estas variantes se producen mediante la ingeniería genética del gen GFP. [15]
Las sondas fluorescentes sintéticas también se pueden utilizar como marcadores fluorescentes. Las ventajas de estos marcadores incluyen un tamaño más pequeño y una mayor variedad de colores. Se pueden utilizar para marcar proteínas de interés de forma más selectiva mediante diversos métodos, incluido el etiquetado basado en el reconocimiento químico, como el uso de marcadores peptídicos quelantes de metales, y el etiquetado basado en el reconocimiento biológico mediante reacciones enzimáticas. [16] Sin embargo, a pesar de su amplia gama de longitudes de onda de excitación y emisión, así como de su mejor estabilidad, las sondas sintéticas tienden a ser tóxicas para la célula y, por lo tanto, no se utilizan generalmente en estudios de imágenes celulares. [1]
Las etiquetas fluorescentes se pueden hibridar con el ARNm para ayudar a visualizar la interacción y la actividad, como la localización del ARNm. Una hebra antisentido marcada con la sonda fluorescente se une a una sola hebra de ARNm y luego se puede observar durante el desarrollo celular para ver el movimiento del ARNm dentro de la célula. [17]
Un fluorógeno es un ligando (ligando fluorogénico) que no es fluorescente en sí mismo, pero cuando se une a una proteína o estructura de ARN específica se vuelve fluorescente. [18]
Por ejemplo, FAST es una variante de la proteína amarilla fotoactiva que fue diseñada para unirse a imitadores químicos del cromóforo tripéptido GFP. [19] De la misma manera, el aptámero de espinaca es una secuencia de ARN diseñada que puede unirse a imitadores químicos del cromóforo GFP, confiriendo así fluorescencia condicional y reversible a las moléculas de ARN que contienen la secuencia. [20]
El marcado fluorescente es conocido por su naturaleza no destructiva y su alta sensibilidad. Esto lo ha convertido en uno de los métodos más utilizados para el marcado y el seguimiento de biomoléculas. [1] Se pueden utilizar varias técnicas de marcado fluorescente según la naturaleza del objetivo.
En el marcaje enzimático, primero se forma un constructo de ADN, utilizando un gen y el ADN de una proteína fluorescente. [21] Después de la transcripción, se forma un híbrido ARN + fluorescente. El objeto de interés se une a una enzima que puede reconocer este ADN híbrido. Por lo general, se utiliza fluoresceína como fluoróforo.
El etiquetado químico o el uso de etiquetas químicas aprovecha la interacción entre una molécula pequeña y una secuencia de aminoácidos genética específica. [22] El etiquetado químico se utiliza a veces como una alternativa para la GFP. Las proteínas sintéticas que funcionan como sondas fluorescentes son más pequeñas que las GFP y, por lo tanto, pueden funcionar como sondas en una variedad más amplia de situaciones. Además, ofrecen una gama más amplia de colores y propiedades fotoquímicas. [23] Con los avances recientes en el etiquetado químico, las etiquetas químicas se prefieren a las proteínas fluorescentes debido a las limitaciones arquitectónicas y de tamaño del barril β característico de la proteína fluorescente. Las alteraciones de las proteínas fluorescentes conducirían a la pérdida de las propiedades fluorescentes. [22]
El etiquetado de proteínas utiliza una etiqueta corta para minimizar la interrupción del plegamiento y la función de las proteínas. Se utilizan metales de transición para unir residuos específicos en las etiquetas a objetivos específicos del sitio, como los extremos N, C o sitios internos dentro de la proteína. Algunos ejemplos de etiquetas utilizadas para el etiquetado de proteínas incluyen etiquetas biarsenicales, etiquetas de histidina y etiquetas FLAG. [1]
La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) es un ejemplo de una técnica de etiquetado genético que utiliza sondas específicas para los sitios cromosómicos a lo largo de la longitud de un cromosoma, también conocida como pintura cromosómica . Múltiples tintes fluorescentes, cada uno con una longitud de onda de excitación y emisión distinta, se unen a una sonda que luego se hibrida con los cromosomas. Un microscopio de fluorescencia puede detectar los tintes presentes y enviarlos a una computadora que puede revelar el cariotipo de una célula. Esta técnica permite revelar anomalías como deleciones y duplicaciones. [24]
Las etiquetas químicas se han adaptado a las tecnologías de imágenes más que las proteínas fluorescentes porque las etiquetas químicas pueden localizar fotosensibilizadores más cerca de las proteínas objetivo. [25] Las proteínas pueden luego etiquetarse y detectarse con imágenes como microscopía de súper resolución , imágenes de Ca 2+ , detección de pH, detección de peróxido de hidrógeno, inactivación de luz asistida por cromóforos y microscopía óptica multifotónica. Los estudios de imágenes in vivo en animales vivos se han realizado por primera vez con el uso de una proteína monomérica derivada de la haloalcano deshalogenasa bacteriana conocida como Halo-tag. [22] [26] El Halo-tag se une covalentemente a su ligando y permite una mejor expresión de proteínas solubles. [26]
Aunque los colorantes fluorescentes pueden no tener la misma sensibilidad que las sondas radiactivas, pueden mostrar la actividad en tiempo real de las moléculas en acción. [27] Además, la radiación y el manejo adecuado ya no son una preocupación.
Con el desarrollo del marcado fluorescente, la microscopía de fluorescencia ha permitido la visualización de proteínas específicas tanto en imágenes fijas como de células vivas. La localización de proteínas específicas ha dado lugar a conceptos importantes en biología celular, como las funciones de distintos grupos de proteínas en las membranas celulares y los orgánulos. En la obtención de imágenes de células vivas, los marcadores fluorescentes permiten controlar los movimientos de las proteínas y sus interacciones. [24]
Los últimos avances en métodos que utilizan marcadores fluorescentes han permitido visualizar el ARNm y su localización en diversos organismos. La obtención de imágenes de ARN en células vivas se puede lograr introduciendo ARN sintetizado acoplado químicamente con un marcador fluorescente en células vivas mediante microinyección. Esta técnica se utilizó para mostrar cómo el ARNm de Oskar en el embrión de Drosophila se localiza en la región posterior del ovocito . [17]
Informamos aquí sobre el desarrollo de reporteros proteicos que generan fluorescencia a partir de moléculas que de otro modo serían oscuras (fluorogénicos).