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Imágenes de calcio

La obtención de imágenes de calcio es una técnica de microscopía para medir ópticamente el estado del calcio (Ca 2+ ) de una célula , tejido o medio aislado. La obtención de imágenes de calcio aprovecha los indicadores de calcio, moléculas fluorescentes que responden a la unión de iones Ca 2+ mediante propiedades de fluorescencia. Existen dos clases principales de indicadores de calcio: indicadores químicos e indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI). [1] Esta técnica ha permitido realizar estudios de la señalización del calcio en una amplia variedad de tipos de células. En las neuronas, la generación de potenciales de acción siempre va acompañada de una rápida afluencia de iones Ca 2+ . Por tanto, la obtención de imágenes de calcio se puede utilizar para monitorizar la actividad eléctrica en cientos de neuronas en cultivos celulares o en animales vivos, lo que ha hecho posible observar la actividad de los circuitos neuronales durante el comportamiento en curso. [2]

Indicadores químicos

Esquema de una configuración típica para la obtención de imágenes de fluorescencia de calcio de miocitos cardíacos aislados

Los indicadores químicos son pequeñas moléculas que pueden quelar iones de calcio. Todas estas moléculas se basan en un homólogo de EGTA llamado BAPTA , con alta selectividad para iones de calcio (Ca 2+ ) frente a iones de magnesio (Mg 2+ ).

Este grupo de indicadores incluye fura-2 , indo-1 , fluo-3 , fluo-4 y Calcium Green-1.

Estos colorantes se utilizan a menudo con los grupos carboxilo quelantes enmascarados como ésteres de acetoximetilo , para hacer que la molécula sea lipófila y permitir una fácil entrada en la célula. Una vez que esta forma del indicador está en la célula, las esterasas celulares liberarán los grupos carboxilo y el indicador podrá unirse al calcio. La forma de ácido libre de los colorantes (es decir, sin la modificación del éster de acetoximetilo) también se puede inyectar directamente en las células a través de un microelectrodo o micropipeta que elimina las incertidumbres en cuanto al compartimento celular que contiene el colorante (el éster de acetoximetilo también puede entrar en el retículo endoplasmático y las mitocondrias ). La unión de un ion Ca 2+ a una molécula indicadora fluorescente conduce a un aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia o un cambio de longitud de onda de emisión/ excitación . Los indicadores fluorescentes químicos individuales de Ca 2+ se utilizan para mediciones de calcio citosólico en una amplia variedad de preparaciones celulares. La primera obtención de imágenes de Ca 2+ en tiempo real (frecuencia de vídeo) se realizó en 1986 en células cardíacas utilizando cámaras de vídeo intensificadas. [3] El desarrollo posterior de la técnica utilizando microscopios confocales de barrido láser reveló señales subcelulares de Ca 2+ en forma de chispas de Ca 2+ y destellos de Ca 2+ . Las respuestas relativas de una combinación de indicadores fluorescentes químicos de Ca 2+ también se utilizaron para cuantificar los transitorios de calcio en orgánulos intracelulares como las mitocondrias . [4]

La obtención de imágenes de calcio, también denominada mapeo de calcio, también se utiliza para realizar investigaciones sobre el tejido miocárdico. [5] El mapeo de calcio es una técnica omnipresente que se utiliza en corazones enteros y aislados, como los de especies de ratón, rata y conejo.

Indicadores de calcio codificados genéticamente

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs) son herramientas poderosas útiles para la obtención de imágenes in vivo de procesos celulares, de desarrollo y fisiológicos. [6] [7] [8] [9] Los GECI no necesitan cargarse de forma aguda en las células; en cambio, los genes que codifican estas proteínas se pueden introducir en células individuales o líneas celulares mediante varios métodos de transfección . También es posible crear animales transgénicos que expresen el indicador en todas las células o de forma selectiva en ciertos subtipos celulares. Los GECI se utilizan para estudiar neuronas, [10] [11] células T , [12] cardiomiocitos , [13] y otros tipos de células. Algunos GECI informan sobre el calcio mediante la emisión directa de fotones ( luminiscencia ), pero la mayoría se basan en proteínas fluorescentes como reporteros, incluida la proteína fluorescente verde GFP y sus variantes (eGFP, YFP, CFP).

De los reporteros fluorescentes, los sistemas indicadores de calcio se pueden clasificar en sistemas de proteína fluorescente simple (FP) y sistemas de proteína fluorescente pareada. Los camgaroos fueron una de las primeras variantes desarrolladas que involucraban un sistema de proteína simple. Los camgaroos aprovechan la calmodulina (CaM), una proteína de unión al calcio. En estas estructuras, la CaM se inserta en el medio de la proteína fluorescente amarilla (YFP) en Y145. Estudios previos de mutagénesis revelaron que las mutaciones en esta posición conferían estabilidad del pH mientras mantenían las propiedades fluorescentes, lo que hace que Y145 sea un punto de inserción de interés. Además, los extremos N y C de YFP están unidos por un enlace peptídico (GGTGGS). Cuando la CaM se une a Ca2+, el pKa efectivo se reduce, lo que permite la desprotonación del cromóforo. [14] Esto da como resultado un aumento de la fluorescencia tras la unión del calcio de forma intensiométrica. Dicha detección contrasta con los sistemas raciométricos, en los que hay un cambio en los espectros de absorbancia/emisión como resultado de la unión de Ca2+. [15] Un sistema de FP único desarrollado posteriormente, denominado G-CaMP , también invoca GFP permutado circularmente. Uno de los extremos está fusionado con CaM y el otro extremo está fusionado con M13 (el dominio de unión de calmodulina de la quinasa ligera de miosina) [16] La proteína está diseñada de tal manera que los extremos están cerca en el espacio, lo que permite que la unión de Ca2+ cause cambios conformacionales y modulación del cromóforo, lo que permite una mayor fluorescencia. G-CaMP y sus variantes refinadas tienen afinidades de unión nanomolares. [17] Una variante final de proteína única es CatchER, que generalmente se considera un indicador de afinidad más baja. Su bolsillo de unión de calcio es bastante negativo; la unión del catión ayuda a proteger la gran concentración de carga negativa y permite recuperar la fluorescencia. [18]

En contraste con estos sistemas, existen sistemas de proteínas fluorescentes pareadas, que incluyen los prototípicos Cameleons . Los Cameleons constan de dos proteínas fluorescentes diferentes, CaM, M13 y un enlace de glicilglicina. [15] En ausencia de Ca2+, solo la proteína fluorescente desplazada al azul del donante será fluorescente. Sin embargo, un cambio conformacional causado por la unión de calcio reposiciona la proteína fluorescente desplazada al rojo, lo que permite que se produzca FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster). Los indicadores de Cameleon producen una señal raciométrica (es decir, la eficiencia de FRET medida depende de la concentración de calcio). Las variantes originales de Cameleons eran originalmente más sensibles al Ca2+ y se extinguían con ácido. [19] Estas deficiencias fueron anuladas por las mutaciones Q69K y V68L. Ambos residuos estaban cerca del cromóforo aniónico enterrado y estas mutaciones probablemente dificultan la protonación, confiriendo una mayor resistencia al pH.

Los GECI de infrarrojo cercano (NIR) tienen una importancia creciente en la detección de calcio, ya que pueden abrir vías para la multiplexación de diferentes sistemas indicadores y permitir una penetración más profunda en los tejidos. Los GECI de infrarrojo cercano se basan en proteínas fluorescentes que se unen a la biliverdina, que se derivan en gran medida de fitocromos bacterianos . Los sistemas de NIR son similares a los pericams inversos en que ambos experimentan una disminución de la fluorescencia al unirse al Ca2+. Los RCaMP y los RGECO son funcionales a más de 700 nm, pero son bastante tenues. [20] También se ha construido con éxito un análogo de Cameleon que implica FRET de NIR. [21]

Una clase especial de GECI está diseñada para formar una etiqueta fluorescente permanente en las neuronas activas. Se basan en la proteína fotoconmutable Eos , que cambia de verde a rojo mediante la escisión de la cadena principal fotocatalizada (con luz violeta). [22] Combinada con la CaM, la luz violeta fotoconvierte solo las neuronas que tienen niveles elevados de calcio. SynTagMA es una versión de CaMPARI2 dirigida a las sinapsis. [23]

Aunque los sistemas fluorescentes se utilizan ampliamente, los reporteros bioluminiscentes de Ca2+ también pueden tener potencial debido a su capacidad para anular la autofluorescencia, el fotoblanqueo [no se necesita longitud de onda de excitación], la degradación biológica y la toxicidad, además de mayores relaciones señal-ruido. [24] Dichos sistemas pueden depender de la aequorina y la coelenterazina luciferina. La unión de Ca2+ provoca un cambio conformacional que facilita la oxidación de la coelenterazina. El fotoproducto resultante emite luz azul a medida que regresa al estado fundamental. La colocalización de la aequorina con GFP facilita BRET/CRET (transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia o quimioluminiscencia), [18] lo que resulta en un aumento de brillo de 19 a 65. Dichas estructuras se pueden utilizar para sondear concentraciones de calcio milimolares a nanomolares. Un sistema similar invoca la obelina y su coelenteramida luciferina, que pueden poseer un tiempo de respuesta al calcio más rápido e insensibilidad al Mg2+ que su contraparte aqueorina. [25] Estos sistemas también pueden aprovechar el autoensamblaje de los componentes de la luciferasa. En un sistema denominado “nano-linterna”, la luciferasa RLuc8 se divide y se coloca en diferentes extremos de la CaM. La unión del calcio acerca los componentes de RLuc8, reformando la luciferasa y permitiéndole transferirse a una proteína fluorescente aceptora.

Para minimizar el daño a las células visualizadas, a menudo se recurre a la microscopía de dos fotones para detectar la fluorescencia de los reporteros. [26] El uso de longitudes de onda cercanas al infrarrojo y la minimización de la dispersión axial de la función puntual [27] permite una resolución nanométrica y una penetración profunda en el tejido. El rango dinámico se determina a menudo a partir de dichas mediciones. Para los indicadores no raciométricos (normalmente indicadores de proteína única), es la relación de las intensidades de fluorescencia obtenidas en condiciones de saturación y agotamiento de Ca2+, respectivamente. Sin embargo, para los indicadores raciométricos, el rango dinámico es la relación entre la relación de eficiencia máxima de FRET (calcio saturado) y la relación de eficiencia mínima de FRET (calcio agotado). Otra cantidad común utilizada para medir las señales producidas por los flujos de concentración de calcio es la relación señal-línea base (SBR), que es simplemente la relación del cambio en la fluorescencia (F - F0) sobre la fluorescencia de línea base. Esto se puede relacionar con la SNR (relación señal/ruido) multiplicando la SBR por la raíz cuadrada del número de fotones contados. [18]

Se ha diseñado una clase especial de indicadores de calcio codificados genéticamente para formar una etiqueta fluorescente permanente en las neuronas activas. Se basan en la proteína fotoconmutable mEos , que cambia de verde a rojo cuando se ilumina con luz violeta. Combinada con el sensor de calcio calmodulina , la luz violeta fotoconvierte únicamente las neuronas que tienen niveles elevados de calcio. SynTagMA es una versión de CaMPARI2 dirigida a las sinapsis.

Uso

Independientemente del tipo de indicador utilizado, el procedimiento de obtención de imágenes es generalmente muy similar. Las células cargadas con un indicador, o que lo expresan en el caso de un GECI, [42] se pueden ver utilizando un microscopio de fluorescencia y capturadas por una cámara Scientific CMOS (sCMOS) [43] o una cámara CCD . Los microscopios confocales y de dos fotones proporcionan capacidad de seccionamiento óptico para que las señales de calcio se puedan resolver en microdominios como espinas dendríticas o botones sinápticos , incluso en muestras gruesas como cerebros de mamíferos. Las imágenes se analizan midiendo los cambios de intensidad de fluorescencia para una sola longitud de onda o dos longitudes de onda expresadas como una relación (indicadores raciométricos). Si es necesario, las intensidades y relaciones de fluorescencia derivadas se pueden graficar contra valores calibrados para niveles conocidos de Ca 2+ para medir concentraciones absolutas de Ca 2+ . Los métodos de microscopía de campo claro [44] amplían la lectura funcional de las capacidades de actividad neuronal en volúmenes 3D.

Métodos como la fotometría de fibra , [45] [46] los miniscopios [47] y la microscopía de dos fotones [48] [49] ofrecen imágenes de calcio en modelos animales de comportamiento libre y con la cabeza fija.

Referencias

  1. ^ de Melo Reis, Ricardo Augusto; Freitas, Hércules Rezende; de Mello, Fernando García (2020). "Imágenes de calcio celular como método confiable para estudiar circuitos neurogliales". Fronteras en Neurociencia . 14 : 975. doi : 10.3389/fnins.2020.569361 . ISSN  1662-453X. PMC  7566175 . PMID  33122991.
  2. ^ Siciliano, Cody A.; Tye, Kay M. (febrero de 2019). "Aprovechamiento de la imagenología del calcio para iluminar la disfunción del circuito en la adicción". Alcohol (Fayetteville, NY) . 74 : 47–63. doi :10.1016/j.alcohol.2018.05.013. ISSN  1873-6823. PMC 7575247. PMID 30470589  . 
  3. ^ Cannell MB, Berlin JR, Lederer WJ (1 de enero de 1987). "Calcio intracelular en miocitos cardíacos: transitorios de calcio medidos mediante imágenes de fluorescencia". Society of General Physiologists Series . 42 : 201–214. PMID  3505361.
  4. ^ Ivannikov MV, Macleod GT (junio de 2013). "Niveles de Ca²⁺ libre mitocondrial y sus efectos sobre el metabolismo energético en las terminales nerviosas motoras de Drosophila". Revista biofísica . 104 (11): 2353–2361. Bibcode :2013BpJ...104.2353I. doi :10.1016/j.bpj.2013.03.064. PMC 3672877 . PMID  23746507. 
  5. ^ Jaimes R, Walton RD, Pasdois P, Bernus O, Efimov IR, Kay MW (junio de 2016). "Una revisión técnica del mapeo óptico del calcio intracelular dentro del tejido miocárdico". Revista estadounidense de fisiología. Fisiología cardíaca y circulatoria . 310 (11): H1388–H1401. doi :10.1152/ajpheart.00665.2015. PMC 4935510. PMID  27016580 . 
  6. ^ Hendel T, Mank M, Schnell B, Griesbeck O, Borst A, Reiff DF (julio de 2008). "Cambios de fluorescencia de indicadores genéticos de calcio y OGB-1 correlacionados con la actividad neuronal y el calcio in vivo e in vitro". The Journal of Neuroscience . 28 (29): 7399–7411. doi :10.1523/JNEUROSCI.1038-08.2008. PMC 6670390 . PMID  18632944. 
  7. ^ Gordon S, Dickinson MH (marzo de 2006). "El papel del calcio en la regulación de la potencia mecánica en el vuelo de los insectos". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 103 (11): 4311–4315. Bibcode :2006PNAS..103.4311G. doi : 10.1073/pnas.0510109103 . PMC 1449689 . PMID  16537527. 
  8. ^ Kerr R, Lev-Ram V, Baird G, Vincent P, Tsien RY, Schafer WR (junio de 2000). "Imágenes ópticas de transitorios de calcio en neuronas y músculo faríngeo de C. elegans". Neuron . 26 (3): 583–59. doi : 10.1016/S0896-6273(00)81196-4 . PMID  10896155. S2CID  311998.
  9. ^ Kim J, Lee S, Jung K, Oh WC, Kim N, Son S, et al. (enero de 2019). "Los biosensores intensiométricos visualizan la actividad de múltiples GTPasas pequeñas in vivo". Nature Communications . 10 (1): 211. Bibcode :2019NatCo..10..211K. doi :10.1038/s41467-018-08217-3. PMC 6331645 . PMID  30643148. 
  10. ^ Afshar Saber W, Gasparoli FM, Dirks MG, Gunn-Moore FJ, Antkowiak M (2018). "Ensayo totalmente óptico para estudiar redes neuronales biológicas". Frontiers in Neuroscience . 12 : 451. doi : 10.3389/fnins.2018.00451 . PMC 6041400 . PMID  30026684. 
  11. ^ Kovalchuk Y, Homma R, Liang Y, Maslyukov A, Hermes M, Thestrup T, et al. (febrero de 2015). "Propiedades de respuesta odorífera in vivo de neuronas adultas migrantes en el bulbo olfatorio del ratón". Nature Communications . 6 : 6349. Bibcode :2015NatCo...6.6349K. doi : 10.1038/ncomms7349 . PMID  25695931.
  12. ^ Mues M, Bartholomäus I, Thestrup T, Griesbeck O, Wekerle H, Kawakami N, Krishnamoorthy G (junio de 2013). "Análisis in vivo en tiempo real de la activación de células T en el sistema nervioso central utilizando un indicador de calcio codificado genéticamente". Nature Medicine . 19 (6): 778–783. doi :10.1038/nm.3180. PMID  23685843. S2CID  205391240.
  13. ^ Shinnawi R, Huber I, Maizels L, Shaheen N, Gepstein A, Arbel G, et al. (octubre de 2015). "Monitoreo de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos con reporteros fluorescentes de voltaje y calcio codificados genéticamente". Informes de células madre . 5 (4): 582–596. doi :10.1016/j.stemcr.2015.08.009. PMC 4624957 . PMID  26372632. 
  14. ^ Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY (septiembre de 1999). "Permutación circular e inserción de receptores dentro de proteínas fluorescentes verdes". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 96 (20): 11241–11246. Bibcode :1999PNAS...9611241B. doi : 10.1073/pnas.96.20.11241 . PMC 18018 . PMID  10500161. 
  15. ^ ab Park JG, Palmer AE (2014). "Medición cuantitativa de Ca2+ y Zn2+ en células de mamíferos utilizando biosensores fluorescentes codificados genéticamente". Biosensores fluorescentes basados ​​en proteínas . Métodos en biología molecular. Vol. 1071. págs. 29–47. doi :10.1007/978-1-62703-622-1_3. ISBN 978-1-62703-621-4. PMC  4051312 . PMID  24052378.
  16. ^ Rodríguez EA, Campbell RE, Lin JY, Lin MZ, Miyawaki A, Palmer AE, et al. (febrero de 2017). "La caja de herramientas creciente y brillante de las proteínas fluorescentes y fotoactivas". Tendencias en ciencias bioquímicas . 42 (2): 111–129. doi :10.1016/j.tibs.2016.09.010. PMC 5272834 . PMID  27814948. 
  17. ^ ab Nakai J, Ohkura M, Imoto K (febrero de 2001). "Una sonda de Ca(2+) con alta relación señal-ruido compuesta por una única proteína fluorescente verde". Nature Biotechnology . 19 (2): 137–141. doi :10.1038/84397. PMID  11175727. S2CID  30254550.
  18. ^ abc Pérez Koldenkova V, Nagai T (julio de 2013). "Indicadores de Ca (2+) genéticamente codificados: propiedades y evaluación". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Investigación de células moleculares . 1833 (7): 1787–1797. doi :10.1016/j.bbamcr.2013.01.011. PMID  23352808.
  19. ^ Miyawaki A, Griesbeck O, Heim R, Tsien RY (marzo de 1999). "Medidas dinámicas y cuantitativas de Ca2+ utilizando camaleones mejorados". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 96 (5): 2135–2140. Bibcode :1999PNAS...96.2135M. doi : 10.1073/pnas.96.5.2135 . PMC 26749 . PMID  10051607. 
  20. ^ Qian Y, Piatkevich KD, Mc Larney B, Abdelfattah AS, Mehta S, Murdock MH y col. (febrero de 2019). "Un indicador de iones de calcio fluorescentes del infrarrojo cercano codificado genéticamente". Métodos de la naturaleza . 16 (2): 171-174. doi :10.1038/s41592-018-0294-6. PMC 6393164 . PMID  30664778. 
  21. ^ Shemetov AA, Monakhov MV, Zhang Q, Canton-Josh JE, Kumar M, Chen M, et al. (marzo de 2021). "Un indicador de calcio codificado genéticamente en el infrarrojo cercano para la obtención de imágenes in vivo". Nature Biotechnology . 39 (3): 368–377. doi :10.1038/s41587-020-0710-1. PMC 7956128 . PMID  33106681. 
  22. ^ Nienhaus K, Nienhaus GU, Wiedenmann J, Nar H (junio de 2005). "Base estructural para la escisión de proteínas fotoinducida y la conversión de verde a rojo de la proteína fluorescente EosFP". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 102 (26): 9156–9159. Bibcode :2005PNAS..102.9156N. doi : 10.1073/pnas.0501874102 . PMC 1166600 . PMID  15964985. 
  23. ^ ab Fosque BF, Sun Y, Dana H, Yang CT, Ohyama T, Tadross MR, et al. (febrero de 2015). "Circuitos neuronales. Etiquetado de circuitos neuronales activos in vivo con integradores de calcio diseñados". Science . 347 (6223): 755–760. doi :10.1126/science.1260922. PMID  25678659. S2CID  206562601.
  24. ^ Baubet V, Le Mouellic H, Campbell AK, Lucas-Meunier E, Fossier P, Brúlet P (junio de 2000). "Proteína fluorescente verde quimérica-aequorina como reporteros bioluminiscentes de Ca2+ a nivel de célula única". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 97 (13): 7260–7265. Bibcode :2000PNAS...97.7260B. doi : 10.1073/pnas.97.13.7260 . PMC 16533 . PMID  10860991. 
  25. ^ Illarionov BA, Frank LA, Illarionova VA, Bondar VS, Vysotski ES, Blinks JR (2000). "Obelina recombinante: clonación y expresión de ADNc, purificación y caracterización como indicador de calcio". Bioluminiscencia y quimioluminiscencia, parte C. Métodos en enzimología. Vol. 305. págs. 223–249. doi :10.1016/s0076-6879(00)05491-4. ISBN 9780121822064. Número de identificación personal  10812604.
  26. ^ Oh, J., Lee, C. y Kaang, BK (2019). Imágenes y análisis de indicadores de calcio codificados genéticamente que vinculan circuitos neuronales y comportamientos. Revista coreana de fisiología y farmacología: revista oficial de la Sociedad Coreana de Fisiología y la Sociedad Coreana de Farmacología, 23(4), 237–249. https://doi.org/10.4196/kjpp.2019.23.4.237
  27. ^ Kaminer I, Nemirovsky J, Segev M (octubre de 2013). "Optimización de la microscopía de fluorescencia multifotónica 3D". Optics Letters . 38 (19): 3945–3948. Bibcode :2013OptL...38.3945K. doi :10.1364/OL.38.003945. PMID  24081095.
  28. ^ Miyawaki A, Llopis J, Heim R, McCaffery JM, Adams JA, Ikura M, Tsien RY (agosto de 1997). "Indicadores fluorescentes de Ca2+ a base de proteínas verdes fluorescentes y calmodulina". Naturaleza . 388 (6645): 882–887. Código Bib :1997Natur.388..882M. doi : 10.1038/42264 . PMID  9278050.
  29. ^ Romoser VA, Hinkle PM, Persechini A (mayo de 1997). "Detección en células vivas de cambios dependientes de Ca2+ en la emisión de fluorescencia de un indicador compuesto por dos variantes de proteína fluorescente verde unidas por una secuencia de unión a calmodulina. Una nueva clase de indicadores fluorescentes". The Journal of Biological Chemistry . 272 ​​(20): 13270–13274. doi : 10.1074/jbc.272.20.13270 . PMID  9148946.
  30. ^ Nagai T, Sawano A, Park ES, Miyawaki A (marzo de 2001). "Proteínas fluorescentes verdes permutadas circularmente diseñadas para detectar Ca2+". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 98 (6): 3197–3202. Bibcode :2001PNAS...98.3197N. doi : 10.1073/pnas.051636098 . PMC 30630 . PMID  11248055. 
  31. ^ Dana H, Sun Y, Mohar B, Hulse BK, Kerlin AM, Hasseman JP, et al. (julio de 2019). "Sensores de calcio de alto rendimiento para la obtención de imágenes de la actividad en poblaciones neuronales y microcompartimentos". Nature Methods . 16 (7): 649–657. doi :10.1038/s41592-019-0435-6. PMID  31209382. S2CID  189927684.
  32. ^ ab Heim N, Griesbeck O (abril de 2004). "Indicadores codificados genéticamente de la dinámica del calcio celular basados ​​en troponina C y proteína fluorescente verde". The Journal of Biological Chemistry . 279 (14): 14280–14286. doi : 10.1074/jbc.M312751200 . PMID  14742421.
  33. ^ Mank M, Reiff DF, Heim N, Friedrich MW, Borst A, Griesbeck O (marzo de 2006). "Un biosensor de calcio basado en FRET con cinética de señal rápida y alto cambio de fluorescencia". Biophysical Journal . 90 (5): 1790–1796. Bibcode :2006BpJ....90.1790M. doi :10.1529/biophysj.105.073536. PMC 1367327 . PMID  16339891. 
  34. ^ Mank M, Santos AF, Direnberger S, Mrsic-Flogel TD, Hofer SB, Stein V, et al. (septiembre de 2008). "Un indicador de calcio codificado genéticamente para la obtención de imágenes crónicas in vivo de dos fotones". Nature Methods . 5 (9): 805–811. doi :10.1038/nmeth.1243. PMID  19160515. S2CID  5501437.
  35. ^ Thestrup T, Litzlbauer J, Bartholomäus I, Mues M, Russo L, Dana H, et al. (febrero de 2014). "Sensores de calcio raciométricos optimizados para la obtención de imágenes funcionales in vivo de neuronas y linfocitos T". Nature Methods . 11 (2): 175–182. doi :10.1038/nmeth.2773. hdl : 11858/00-001M-0000-0017-C32A-B . PMID  24390440. S2CID  11620748.
  36. ^ Akerboom J, Carreras Calderón N, Tian L, Wabnig S, Prigge M, Tolö J, et al. (2013). "Indicadores de calcio codificados genéticamente para imágenes de actividad neuronal multicolor y combinación con optogenética". Frontiers in Molecular Neuroscience . 6 : 2. doi : 10.3389/fnmol.2013.00002 . PMC 3586699 . PMID  23459413. 
  37. ^ Dana H, Mohar B, Sun Y, Narayan S, Gordus A, Hasseman JP, et al. (marzo de 2016). "Indicadores sensibles de calcio de proteína roja para la obtención de imágenes de la actividad neuronal". eLife . 5 : e12727. doi : 10.7554/eLife.12727 . PMC 4846379 . PMID  27011354. 
  38. ^ Zhao Y, Araki S, Wu J, Teramoto T, Chang YF, Nakano M, et al. (septiembre de 2011). "Una paleta expandida de indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente". Science . 333 (6051): 1888–1891. Bibcode :2011Sci...333.1888Z. doi :10.1126/science.1208592. PMC 3560286 . PMID  21903779. 
  39. ^ Moeyaert B, Holt G, Madangopal R, Perez-Alvarez A, Fearey BC, Trojanowski NF, et al. (octubre de 2018). "Métodos mejorados para marcar poblaciones de neuronas activas". Nature Communications . 9 (1): 4440. Bibcode :2018NatCo...9.4440M. doi :10.1038/s41467-018-06935-2. PMC 6202339 . PMID  30361563. 
  40. ^ Perez-Alvarez A, Fearey BC, O'Toole RJ, Yang W, Arganda-Carreras I, Lamothe-Molina PJ, et al. (mayo de 2020). "Imágenes de imagen congelada de la actividad sináptica utilizando SynTagMA". Nature Communications . 11 (1): 2464. Bibcode :2020NatCo..11.2464P. doi :10.1038/s41467-020-16315-4. PMC 7235013 . PMID  32424147. 
  41. ^ Perez-Alvarez A, Huhn F, Dürst CD, Franzelin A, Lamothe-Molina PJ, Oertner TG (2021). "Imágenes de fotograma congelado de señales de calcio dendrítico con TubuTag". Frontiers in Molecular Neuroscience . 14 : 635820. doi : 10.3389/fnmol.2021.635820 . PMC 7982875 . PMID  33762909. 
  42. ^ Akerboom, Jasper; Tian, ​​Lin; Marvin, Jonathan S.; Looger, Loren L. (2012), Martin, Jean-René (ed.), "Ingeniería y aplicación de indicadores de calcio codificados genéticamente", Genetically Encoded Functional Indicators , Totowa, NJ: Humana Press, págs. 125-147, doi :10.1007/978-1-62703-014-4_8, ISBN 978-1-62703-014-4, consultado el 15 de marzo de 2024
  43. ^ Nguyen JP, Shipley FB, Linder AN, Plummer GS, Liu M, Setru SU, et al. (febrero de 2016). "Imágenes de calcio de todo el cerebro con resolución celular en Caenorhabditis elegans de comportamiento libre". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 113 (8): E1074–E1081. arXiv : 1501.03463 . Bibcode :2016PNAS..113E1074N. doi : 10.1073/pnas.1507110112 . PMC 4776509 . PMID  26712014. 
  44. ^ Pégard NC, Liu HY, Antipa N, Gerlock M, Adesnik H, Waller L (mayo de 2016). "Microscopía de campo de luz compresiva para registro de actividad neuronal en 3D". Optica . 3 (5): 517–24. Bibcode :2016Optic...3..517P. doi : 10.1364/optica.3.000517 .
  45. ^ Wang Y, DeMarco EM, Witzel LS, Keighron JD (febrero de 2021). "Una revisión seleccionada de los avances recientes en el estudio de los circuitos neuronales mediante fotometría de fibra". Farmacología, bioquímica y comportamiento . 201 : 173113. doi :10.1016/j.pbb.2021.173113. PMID  33444597. S2CID  231579597.
  46. ^ Sych Y, Chernysheva M, Sumanovski LT, Helmchen F (junio de 2019). "Fotometría multifibra de alta densidad para estudiar la dinámica de circuitos cerebrales a gran escala" (PDF) . Nature Methods . 16 (6): 553–560. doi :10.1038/s41592-019-0400-4. PMID  31086339. S2CID  152283372.
  47. ^ Resendez SL, Jennings JH, Ung RL, Namboodiri VM, Zhou ZC, Otis JM, et al. (marzo de 2016). "Visualización de la dinámica de los circuitos neuronales cerebrales corticales, subcorticales y profundos durante el comportamiento naturalista de los mamíferos con microscopios montados en la cabeza y lentes implantados crónicamente". Nature Protocols . 11 (3): 566–597. doi :10.1038/nprot.2016.021. PMC 5239057 . PMID  26914316. 
  48. ^ Jung JC, Mehta AD, Aksay E, Stepnoski R, Schnitzer MJ (noviembre de 2004). "Imágenes in vivo del cerebro de mamíferos mediante microendoscopia de fluorescencia de uno y dos fotones". Journal of Neurophysiology . 92 (5): 3121–3133. doi :10.1152/jn.00234.2004. PMC 2826362 . PMID  15128753. 
  49. ^ Svoboda K , Yasuda R (junio de 2006). "Principios de la microscopía de excitación de dos fotones y sus aplicaciones a la neurociencia". Neuron . 50 (6): 823–839. doi : 10.1016/j.neuron.2006.05.019 . PMID:  16772166. S2CID  : 7278880.

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