La microscopía de contraste de fases (PCM) es una técnica de microscopía óptica que convierte los cambios de fase de la luz que pasa a través de una muestra transparente en cambios de brillo en la imagen. Los cambios de fase en sí mismos son invisibles, pero se vuelven visibles cuando se muestran como variaciones de brillo.
Cuando las ondas de luz viajan a través de un medio distinto del vacío , la interacción con el medio hace que la amplitud y la fase de la onda cambien de una manera que depende de las propiedades del medio. Los cambios de amplitud (luminosidad) surgen de la dispersión y absorción de la luz, que a menudo depende de la longitud de onda y puede dar lugar a colores. Los equipos fotográficos y el ojo humano solo son sensibles a las variaciones de amplitud. Sin dispositivos especiales, los cambios de fase son, por lo tanto, invisibles. Sin embargo, los cambios de fase a menudo transmiten información importante.
La microscopía de contraste de fases es particularmente importante en biología. Revela muchas estructuras celulares que son invisibles con un microscopio de campo claro , como se ejemplifica en la figura. Estas estructuras se hicieron visibles para los primeros microscopistas mediante tinción , pero esto requirió una preparación adicional y la muerte de las células. El microscopio de contraste de fases hizo posible que los biólogos estudiaran las células vivas y cómo proliferan a través de la división celular . Es uno de los pocos métodos disponibles para cuantificar la estructura y los componentes celulares sin usar fluorescencia . [1] Después de su invención a principios de la década de 1930, [2] la microscopía de contraste de fases demostró ser un avance tal en microscopía que su inventor Frits Zernike recibió el Premio Nobel de Física en 1953. [3] La mujer que fabricó este microscopio, Caroline Bleeker , a menudo permanece sin crédito.
El principio básico para hacer visibles los cambios de fase en la microscopía de contraste de fases es separar la luz iluminadora (de fondo) de la luz dispersada por la muestra (que constituye los detalles del primer plano) y manipularlas de forma diferente.
La luz de iluminación en forma de anillo (verde) que pasa por el anillo del condensador se enfoca en la muestra mediante el condensador. Parte de la luz de iluminación se dispersa por la muestra (amarilla). La luz restante no se ve afectada por la muestra y forma la luz de fondo (roja). Cuando se observa una muestra biológica sin teñir, la luz dispersa es débil y normalmente está desfasada en −90° (debido tanto al grosor típico de las muestras como a la diferencia del índice de refracción entre el tejido biológico y el medio circundante) en relación con la luz de fondo. Esto hace que el primer plano (vector azul) y el fondo (vector rojo) tengan casi la misma intensidad, lo que da como resultado un bajo contraste de imagen .
En un microscopio de contraste de fases, el contraste de la imagen se incrementa de dos maneras: generando interferencia constructiva entre los rayos de luz dispersos y de fondo en las regiones del campo de visión que contienen la muestra, y reduciendo la cantidad de luz de fondo que llega al plano de la imagen. [4] Primero, la luz de fondo se desplaza en fase -90° al pasarla a través de un anillo de desplazamiento de fase, que elimina la diferencia de fase entre el fondo y los rayos de luz dispersos.
Cuando la luz se enfoca entonces en el plano de la imagen (donde se coloca una cámara o un ocular), este cambio de fase hace que los rayos de luz de fondo y dispersos que se originan en regiones del campo de visión que contienen la muestra (es decir, el primer plano) interfieran de manera constructiva , lo que resulta en un aumento del brillo de estas áreas en comparación con las regiones que no contienen la muestra. Finalmente, el fondo se atenúa ~70-90% mediante un anillo de filtro gris ; este método maximiza la cantidad de luz dispersa generada por la luz de iluminación, al tiempo que minimiza la cantidad de luz de iluminación que llega al plano de la imagen. Parte de la luz dispersa que ilumina toda la superficie del filtro se verá desfasada y atenuada por los anillos, pero en una medida mucho menor que la luz de fondo, que solo ilumina los anillos de filtro de cambio de fase y gris.
Lo anterior describe el contraste de fase negativo . En su forma positiva , la luz de fondo está desfasada en +90°. Por lo tanto, la luz de fondo estará desfasada 180° con respecto a la luz dispersa. La luz dispersa se restará entonces de la luz de fondo para formar una imagen con un primer plano más oscuro y un fondo más claro, como se muestra en la primera figura. [5] [6] [7]
El éxito del microscopio de contraste de fases ha dado lugar a una serie de métodos posteriores de obtención de imágenes de fases . En 1952, Georges Nomarski patentó lo que hoy se conoce como microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) . [8] Mejora el contraste creando sombras artificiales, como si el objeto estuviera iluminado desde un lado. Pero la microscopía DIC no es adecuada cuando el objeto o su recipiente alteran la polarización. Con el creciente uso de recipientes de plástico polarizantes en biología celular, la microscopía DIC se sustituye cada vez más por la microscopía de contraste de modulación de Hoffman , inventada por Robert Hoffman en 1975. [9]
Los métodos tradicionales de contraste de fase mejoran el contraste ópticamente, combinando la información de brillo y fase en una sola imagen. Desde la introducción de la cámara digital a mediados de la década de 1990, se han desarrollado varios métodos nuevos de obtención de imágenes de fase digitales, conocidos colectivamente como microscopía cuantitativa de contraste de fase . Estos métodos crean digitalmente dos imágenes separadas, una imagen de campo claro ordinaria y una denominada imagen de desplazamiento de fase . En cada punto de la imagen, la imagen de desplazamiento de fase muestra el desplazamiento de fase cuantificado inducido por el objeto, que es proporcional al espesor óptico del objeto. [10] De esta manera, la medición del campo óptico asociado puede remediar los artefactos de halo asociados con el contraste de fase convencional al resolver un problema óptico inverso para reconstruir computacionalmente el potencial de dispersión del objeto. [11]
