La microscopía de localización fotoactivada ( PALM o FPALM ) [1] [2] y la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) [3] son métodos de obtención de imágenes de microscopía de fluorescencia de campo amplio (a diferencia de las técnicas de escaneo puntual como la microscopía confocal de escaneo láser ) que permiten obtener imágenes con una resolución más allá del límite de difracción . Los métodos se propusieron en 2006 a raíz del surgimiento general de los métodos de microscopía óptica de superresolución , y fueron presentados como Métodos del año 2008 por la revista Nature Methods . [4] El desarrollo de PALM como método de obtención de imágenes biofísicas dirigido fue impulsado en gran medida por el descubrimiento de nuevas especies y la ingeniería de mutantes de proteínas fluorescentes que muestran un fotocromismo controlable, como la GFP fotoactivable . Sin embargo, el desarrollo concomitante de STORM, que comparte el mismo principio fundamental, originalmente utilizó tintes de cianina emparejados . Una molécula del par (llamada activadora), cuando se excita cerca de su máximo de absorción, sirve para reactivar la otra molécula (llamada reportera) al estado fluorescente.
Para PALM, STORM y técnicas relacionadas se utiliza un número cada vez mayor de colorantes, tanto fluoróforos orgánicos como proteínas fluorescentes. Algunos son compatibles con imágenes de células vivas, otros permiten una adquisición más rápida o un etiquetado más denso. La elección de un fluoróforo particular depende en última instancia de la aplicación y de sus propiedades fotofísicas subyacentes. [5]
Ambas técnicas han experimentado importantes avances técnicos [6] , en particular permitiendo la obtención de imágenes multicolores y la extensión a tres dimensiones, con la mejor resolución axial actual de 10 nm en la tercera dimensión obtenida mediante un enfoque interferométrico con dos objetivos opuestos que recogen la fluorescencia de la muestra. [7]
La microscopía de fluorescencia convencional se realiza tiñendo selectivamente la muestra con moléculas fluorescentes , ya sea unidas a anticuerpos como en inmunohistoquímica o utilizando proteínas fluorescentes fusionadas genéticamente con los genes de interés. Normalmente, cuanto más concentrados estén los fluoróforos, mejor será el contraste de la imagen de fluorescencia.
Un solo fluoróforo puede visualizarse bajo un microscopio (o incluso a simple vista [8] ) si el número de fotones emitidos es suficientemente alto y, en cambio, el fondo es lo suficientemente bajo. La imagen bidimensional de una fuente puntual observada bajo un microscopio es un punto extendido, correspondiente al disco de Airy (una sección de la función de dispersión puntual ) del sistema de imágenes. La capacidad de identificar como dos entidades individuales dos fluoróforos estrechamente espaciados está limitada por la difracción de la luz. Esto se cuantifica mediante el criterio de Abbe , quien establece que la distancia mínima que permite resolver dos fuentes puntuales está dada por
donde es la longitud de onda de la emisión fluorescente y NA es la apertura numérica del microscopio. El límite de resolución teórica en la longitud de onda de excitación práctica más corta es de alrededor de 150 nm en la dimensión lateral y se acerca a los 400 nm en la dimensión axial (si se utiliza un objetivo que tiene una apertura numérica de 1,40 y la longitud de onda de excitación es de 400 nm).
Sin embargo, si se distingue la emisión de las dos moléculas fluorescentes vecinas, es decir, se pueden identificar los fotones procedentes de cada una de las dos, entonces es posible superar el límite de difracción. [9] Una vez que se recolecta un conjunto de fotones de una molécula específica, se forma un punto de difracción limitada en el plano de imagen del microscopio. El centro de este punto se puede encontrar ajustando el perfil de emisión observado a una función geométrica conocida, típicamente una función gaussiana en dos dimensiones. El error que se comete al localizar el centro de un emisor puntual se escala a una primera aproximación como la raíz cuadrada inversa del número de fotones emitidos, y si se recogen suficientes fotones es fácil obtener un error de localización mucho menor que el punto original. función de propagación.
Los dos pasos de identificación y localización de moléculas fluorescentes individuales en un entorno denso donde hay muchas están presentes son la base de PALM, STORM y su desarrollo.
Aunque existen muchos enfoques para la identificación molecular, el fotocromismo inducido por la luz de fluoróforos seleccionados se desarrolló como el enfoque más prometedor para distinguir moléculas vecinas separando su emisión fluorescente en el tiempo. Al encender subconjuntos estocásticamente dispersos de fluoróforos con luz de una longitud de onda específica, las moléculas individuales pueden excitarse y obtener imágenes de acuerdo con sus espectros. Para evitar la acumulación de fluoróforos activos en la muestra, que eventualmente se degradarían nuevamente a una imagen limitada por difracción, en PALM se aprovecha el fenómeno de fotoblanqueo que ocurre espontáneamente , mientras que el cambio reversible entre un estado fluorescente encendido y un estado oscuro apagado de Se explota un tinte en STORM.
En resumen, PALM y STORM se basan en recoger bajo un microscopio fluorescente un gran número de imágenes, cada una de las cuales contiene sólo unos pocos fluoróforos aislados activos. La secuencia de imágenes permite los numerosos ciclos de emisión necesarios para activar estocásticamente cada fluoróforo desde un estado no emisivo (o menos emisivo) a un estado brillante y de regreso a un estado no emisivo o blanqueado. Durante cada ciclo, la densidad de las moléculas activadas se mantiene lo suficientemente baja como para que las imágenes moleculares de los fluoróforos individuales no se superpongan normalmente.
En cada imagen de la secuencia, la posición de un fluoróforo se calcula con una precisión típicamente superior al límite de difracción -en el rango típico de unos pocos a decenas de nm- y la información resultante de la posición de los centros de todos los fluoróforos localizados moléculas se utiliza para construir la imagen PALM o STORM de súper resolución.
La precisión de la localización se puede calcular según la fórmula:
donde N es el número de fotones recolectados, a es el tamaño de píxel del detector de imágenes, es la señal de fondo promedio y es la desviación estándar de la función de dispersión de puntos. [10] El requisito de localizar al mismo tiempo múltiples fluoróforos simultáneamente en un área extendida determina la razón por la cual estos métodos son de campo amplio, empleando como detector una cámara CCD , EMCCD o CMOS .
El requisito de una relación señal-ruido mejorada para maximizar la precisión de la localización determina la combinación frecuente de este concepto con microscopios fluorescentes de campo amplio que permiten el corte óptico, como los microscopios de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y los microscopios de fluorescencia de lámina de luz .
La resolución de la imagen final está limitada por la precisión de cada localización y el número de localizaciones, en lugar de por la difracción. La imagen de superresolución es, por tanto, una representación puntillista de las coordenadas de todas las moléculas localizadas. La imagen de súper resolución se genera comúnmente representando cada molécula en el plano de la imagen como una gaussiana bidimensional con una amplitud proporcional al número de fotones recolectados y la desviación estándar dependiendo de la precisión de la localización.
Las peculiares propiedades fotofísicas de los fluoróforos empleados en las imágenes de súper resolución PALM/STORM plantean limitaciones y oportunidades para las imágenes multicolores. Hasta ahora han surgido tres estrategias: excitación de fluoróforos espectralmente separados usando un divisor de haz de emisión, [12] uso de múltiples activadores/informadores en modo STORM [13] [14] e imágenes radiométricas de fluoróforos espectralmente cercanos. [15]
Aunque originalmente se desarrollaron como métodos de imágenes 2D (x,y), PALM y STORM se han convertido rápidamente en técnicas con capacidad 3D (x,y,z). Para determinar la posición axial de un único fluoróforo en la muestra, actualmente se utilizan los siguientes enfoques: modificación de la función de dispersión de puntos para introducir características dependientes de z en la imagen 2D (x,y) (el enfoque más común es introducir astigmatismo en el PSF); detección multiplano , donde la posición axial se determina comparando dos imágenes de un mismo PSF desenfocadas una respecto de la otra; determinación interferométrica de la posición axial del emisor utilizando dos objetivos opuestos y múltiples detectores; [7] uso de enfoque temporal para limitar la excitación/activación; uso de excitación/activación de láminas de luz para limitar una capa de unos pocos cientos de nanómetros de espesor colocada arbitrariamente a lo largo del plano z dentro de la muestra.
El requisito de múltiples ciclos de activación, excitación y desactivación/blanqueo normalmente implicaría períodos de tiempo prolongados para formar una imagen PALM/STORM y, por lo tanto, operación en una muestra fija. Ya en 2007 se publicaron varios trabajos [16] que realizaban PALM/STORM en células vivas. La capacidad de realizar imágenes en vivo de superresolución utilizando estas técnicas depende en última instancia de las limitaciones técnicas para recolectar suficientes fotones de un solo emisor en muy poco tiempo. Esto depende tanto de las limitaciones fotofísicas de la sonda como de la sensibilidad del detector empleado. Procesos relativamente lentos (de segundos a decenas de segundos), como la modificación en la organización de las adherencias focales, se han investigado mediante PALM, [17] mientras que STORM ha permitido obtener imágenes de procesos más rápidos, como la difusión por membrana de fosas recubiertas de clatrina o la fisión mitocondrial. procesos de fusión. Una aplicación prometedora de PALM de células vivas es el uso de fotoactivación para realizar un seguimiento de partículas individuales de alta densidad (sptPALM [18] ), superando la limitación tradicional del seguimiento de partículas individuales para trabajar con sistemas que muestran una concentración muy baja de fluoróforos.
Si bien las mediciones tradicionales PALM y STORM se utilizan para determinar la estructura física de una muestra, y las intensidades de los eventos fluorescentes determinan la certeza de la localización, estas intensidades también se pueden utilizar para mapear las interacciones de los fluoróforos con estructuras nanofotónicas . Esto se ha realizado tanto en estructuras metálicas ( plasmónicas ), como nanobarras de oro, [19] [20] como en estructuras semiconductoras, como nanocables de silicio. [21] Estos enfoques pueden usarse para fluoróforos funcionalizados en la superficie de la muestra de interés (como para los estudios de partículas plasmónicas mencionados aquí) o adsorbidos aleatoriamente en el sustrato que rodea la muestra, lo que permite un mapeo 2D completo de las interacciones fluoróforo-nanoestructura. en todas las posiciones relativas a la estructura. [21]
Estos estudios han encontrado que, además de la incertidumbre estándar de localización debido al ajuste de la función de dispersión de puntos , la autointerferencia con la luz dispersada por nanopartículas puede provocar distorsiones o desplazamientos de las funciones de dispersión de puntos de las imágenes, [20] [ 21 ] el análisis de dichas mediciones. Sin embargo, es posible limitarlos, por ejemplo, incorporando máscaras de metasuperficie que controlen la distribución angular de la luz permitida en el sistema de medición. [22]
PALM y STORM comparten un principio fundamental común, y numerosos desarrollos han tendido a entrelazar aún más las dos técnicas. Aún así, se diferencian en varios detalles técnicos y en un punto fundamental. Desde el punto de vista técnico, PALM se realiza en una muestra biológica utilizando fluoróforos expresados de forma exógena en forma de construcciones de fusión genética con una proteína fluorescente fotoactivable. En cambio, STORM utiliza el inmunomarcaje de moléculas endógenas en la muestra con anticuerpos etiquetados con fluoróforos orgánicos. En ambos casos, los fluoróforos son conducidos entre un estado activo-ENCENDIDO y un estado inactivo-APAGADO por la luz. En PALM, sin embargo, la fotoactivación y el fotoblanqueo limitan la vida del fluoróforo a un intervalo de tiempo limitado, y es deseable una emisión continua del fluoróforo en el medio sin ninguna intermitencia de fluorescencia. En STORM, el fotoparpadeo estocástico de los fluoróforos orgánicos (normalmente más brillantes que las proteínas fluorescentes) se aprovechó originalmente para separar colorantes vecinos. En este sentido, cuanto más intenso sea el parpadeo, mayor será la probabilidad de distinguir dos fluoróforos vecinos.
En este sentido, varios trabajos de investigación han explorado el potencial de PALM para realizar una cuantificación del número de fluoróforos (y por tanto de proteínas de interés) presentes en una muestra mediante el conteo de los fluoróforos activados. [11] [23] [24] El enfoque utilizado para tratar la dinámica fluorescente de la etiqueta fluorescente utilizada en los experimentos determinará la apariencia final de la imagen de superresolución y la posibilidad de determinar una correspondencia inequívoca entre un evento de localización y una proteína en la muestra.
{{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace )