La microscopía de espectro de fuerzas (FSM) es una aplicación de microrreología activa desarrollada para medir fuerzas aleatorias agregadas en el citoplasma . [1] Se inyectan trazadores de flujo grandes e inertes en células vivas y se alojan dentro de la malla citoesquelética , donde oscilan por las repercusiones de las proteínas motoras activas. La magnitud de estas fuerzas aleatorias se puede inferir de la frecuencia de oscilación de las partículas trazadoras. El seguimiento de las fluctuaciones de las partículas trazadoras mediante microscopía óptica puede aislar la contribución de las fuerzas aleatorias activas al transporte molecular intracelular de la del movimiento browniano .
FSM fue desarrollado por Ming Guo y David A. Weitz para sondear fuerzas intracelulares estocásticas generadas por proteínas motoras. [1] Lejos de ser un vacío líquido, el citoplasma contiene una red compleja de actina y miosina que confiere soporte estructural a la célula, además de albergar vesículas y mitocondrias, entre otros orgánulos. [2] Investigaciones recientes sobre el hacinamiento macromolecular dentro del citoplasma plantean preocupaciones sobre si el movimiento de tipo difuso de moléculas grandes se ha atribuido erróneamente a las fuerzas brownianas. [3] En cambio, existen sospechas de que las proteínas motoras de miosina , que tiran aleatoriamente de los filamentos de actina incrustados con moléculas grandes, dan lugar a un movimiento de tipo difusivo de las moléculas dentro de las células. [3] [4] Guo et al. desarrolló un ensayo para distinguir si el movimiento de las partículas dentro de las células es impulsado por la difusión térmica o por las repercusiones de proteínas motoras activas como la miosina II no muscular que sacude el citoesqueleto celular.
FSM se basa en la inyección de partículas trazadoras recubiertas con polietilenglicol (PEG) más grandes que el tamaño de la malla citoesquelética (>50 nm), [5] colocándose entre una red de filamentos de actina y proteínas motoras de miosina. A medida que las proteínas motoras de miosina tiran de los filamentos de actina para realizar el trabajo celular, estas fluctuaciones de actina oscilan invariablemente las partículas PEGiladas vecinas. La magnitud de la fluctuación del trazador es proporcional a la magnitud de las fuerzas motoras activas agregadas. Por lo tanto, al registrar el desplazamiento de las oscilaciones del trazador, FSM puede medir y derivar la magnitud de las fuerzas ejercidas por las proteínas motoras activas. [1]
Las fluctuaciones de los trazadores pegilados acoplados a las fuerzas motoras agregadas de la miosina pueden compararse con un resorte de Hooke ,
donde la fuerza aplicada para generar el desplazamiento de oscilación es proporcional a la constante de resorte efectiva del entorno intracelular. El desplazamiento durante la oscilación es una función espacial del tiempo, que puede medirse directamente mediante microscopía óptica. [1] Luego, una transformada de Fourier asigna información en el dominio temporal al dominio de la frecuencia para derivar una dimensión útil en función de la frecuencia,
donde , y son formas cuadráticas de fuerza, elasticidad y desplazamiento promediados utilizados para tener en cuenta las fuerzas estocásticas. [1] El desplazamiento cuadrático medio promediado en el tiempo se puede recuperar mediante una transformada de Fourier desde el dominio de la frecuencia hasta el dominio temporal. En el contexto de la frecuencia de oscilación, cuanto mayor sea el espectro de frecuencia de la fuerza, mayor será la actividad metabólica de la célula. [6] Mediciones micromecánicas independientes pueden calcular la elasticidad del citoplasma. Al utilizar una pinza óptica para aplicar una fuerza prescrita a una partícula trazadora, FSM puede medir el desplazamiento resultante para estimar la constante elástica del resorte. [7] [8]
La oscilación dirigida de las partículas trazadoras utilizando pinzas ópticas dio como resultado un desplazamiento casi sincronizado con la fuerza aplicada, lo que sugiere que el citoplasma está materialmente más cerca de un sólido elástico. [1] Esto contrasta fuertemente con la hipótesis anterior de que el citoplasma es un fluido viscoelástico en el que las moléculas grandes pueden difundir libremente. [9] En las células agotadas en ATP , en las que la miosina II no muscular está inactivada, los experimentos de FSM revelan que las partículas trazadoras dejan de oscilar como si el citoplasma se hubiera solidificado. [1] Las miosina II son proteínas motoras que se unen y tiran de los filamentos de actina mediante la hidrólisis del ATP. [10] Esto corrobora aún más el hallazgo de que en las bacterias privadas de nutrientes , el citoplasma se transforma en una sustancia similar al vidrio. [11] Por lo tanto, la hidrólisis de ATP por proteínas motoras parece ser fundamental para mantener la fluidez citoplasmática, que es crucial para el transporte de vesículas y el movimiento de difusión en el citoesqueleto. [1]
Al medir el estado general de actividad dentro de una célula, la FSM se puede aplicar para identificar células cancerosas malignas , que se caracterizan por ser más elásticas [12] y más móviles. Las mediciones de FSM en células de cáncer de mama MCF-7 malignas y células de cáncer de mama MCF-10A benignas revelaron una separación estadísticamente significativa en el espectro de fuerzas que permite a FSM realizar análisis para detectar cáncer metastásico . [1] La dimensionalidad del entorno extracelular influye en gran medida en las mediciones FSM de células cancerosas. En una matriz 3D, las células de cáncer de mama metastásico MDA-MB-231 tenían comparativamente más citoplasma sólido que sus contrapartes cultivadas en placas 2D. [13]
