En biología molecular y biotecnología , una etiqueta fluorescente , también conocida como etiqueta fluorescente o sonda fluorescente , es una molécula que se une químicamente para ayudar en la detección de una biomolécula como una proteína, un anticuerpo o un aminoácido. Generalmente, el marcado o etiquetado fluorescente utiliza un derivado reactivo de una molécula fluorescente conocida como fluoróforo . El fluoróforo se une selectivamente a una región específica o grupo funcional en la molécula objetivo y puede unirse química o biológicamente. [1] Se utilizan ampliamente diversas técnicas de etiquetado, como el etiquetado enzimático, el etiquetado de proteínas y el etiquetado genético. El bromuro de etidio , la fluoresceína y la proteína verde fluorescente son etiquetas comunes. Las moléculas marcadas más comúnmente son anticuerpos, proteínas, aminoácidos y péptidos que luego se utilizan como sondas específicas para la detección de un objetivo particular. [2]
El desarrollo de métodos para detectar e identificar biomoléculas ha estado motivado por la capacidad de mejorar el estudio de la estructura molecular y las interacciones. Antes de la llegada del marcaje fluorescente, se utilizaban radioisótopos para detectar e identificar compuestos moleculares. Desde entonces, se han desarrollado métodos más seguros que implican el uso de tintes fluorescentes o proteínas fluorescentes como etiquetas o sondas como medio para marcar e identificar biomoléculas. [3] Aunque el etiquetado fluorescente a este respecto se ha utilizado recientemente, el descubrimiento de la fluorescencia existe desde hace mucho más tiempo.
Sir George Stokes desarrolló la Ley de Fluorescencia de Stokes en 1852, que establece que la longitud de onda de la emisión de fluorescencia es mayor que la de la radiación excitante. Richard Meyer luego lo denominó fluoróforo en 1897 para describir un grupo químico asociado con la fluorescencia. Desde entonces, la fluoresceína fue creada como un tinte fluorescente por Adolph von Baeyer en 1871 y el método de tinción se desarrolló y utilizó con el desarrollo de la microscopía de fluorescencia en 1911. [4]
El bromuro de etidio y sus variantes se desarrollaron en la década de 1950 [4] y en 1994 se introdujeron las proteínas fluorescentes o FP. [5] La proteína verde fluorescente o GFP fue descubierta por Osamu Shimomura en la década de 1960 y fue desarrollada como una molécula trazadora por Douglas Prasher en 1987. [6] Las FP condujeron a un gran avance en la obtención de imágenes de células vivas con la capacidad de marcar selectivamente regiones genéticas de proteínas. y observar las funciones y mecanismos de las proteínas. [5] Por este avance, Shimomura recibió el Premio Nobel en 2008. [7]
Se han desarrollado nuevos métodos para rastrear biomoléculas, incluido el uso de biosensores colorimétricos, compuestos fotocromáticos, biomateriales y sensores electroquímicos. El etiquetado fluorescente también es un método común en el que las aplicaciones se han ampliado al etiquetado enzimático, al etiquetado químico, al etiquetado de proteínas y al etiquetado genético. [1]
Actualmente existen varios métodos de etiquetado para el seguimiento de biomoléculas. Algunos de los métodos incluyen los siguientes.
Las especies comunes para las que se utilizan marcadores isotópicos incluyen proteínas. En este caso, se incorporan aminoácidos con isótopos estables de carbono, nitrógeno o hidrógeno a secuencias polipeptídicas. [8] Estos polipéptidos luego se someten a espectrometría de masas . Debido al cambio definido exactamente en el que estos isótopos incurren en los péptidos, es posible saber a través del gráfico de espectrometría qué péptidos contenían los isótopos. Al hacerlo, se puede extraer la proteína de interés de varias otras en un grupo. Los compuestos isotópicos desempeñan un papel importante como fotocromos, que se describe a continuación.
Los biosensores están unidos a una sustancia de interés. Normalmente, esta sustancia no sería capaz de absorber la luz, pero con el biosensor adjunto, la luz puede absorberse y emitirse en un espectrofotómetro . [9] Además, los biosensores que son fluorescentes se pueden ver a simple vista. Algunos biosensores fluorescentes también tienen la capacidad de cambiar de color en entornos cambiantes (por ejemplo, de azul a rojo). Un investigador podría inspeccionar y obtener datos sobre el entorno circundante en función del color que pueda ver visiblemente en la especie híbrida biosensor-molécula. [10]
Los ensayos colorimétricos se utilizan normalmente para determinar cuánta concentración de una especie hay en relación con otra. [9]
Los compuestos fotocromáticos tienen la capacidad de cambiar entre una gama o variedad de colores. Su capacidad para mostrar diferentes colores radica en cómo absorben la luz. Las diferentes manifestaciones isoméricas de la molécula absorben diferentes longitudes de onda de luz, de modo que cada especie isomérica puede mostrar un color diferente según su absorción. Estos incluyen compuestos fotoconmutables, que son proteínas que pueden cambiar de un estado no fluorescente a uno fluorescente en un entorno determinado. [11]
La molécula orgánica más común que se utiliza como fotocromo es el diarileteno . [12] Otros ejemplos de proteínas fotoconmutables incluyen PADRON-C, rs-FastLIME-s y bs-DRONPA-s, que pueden usarse en células vegetales y de mamíferos por igual para observar cómo las células se mueven en diferentes entornos. [11]
Los biomateriales fluorescentes son una posible forma de utilizar factores externos para observar un camino de manera más visible. El método implica marcar con fluorescencia moléculas peptídicas que alterarían la vía natural de un organismo. Cuando este péptido se inserta en la célula del organismo, puede inducir una reacción diferente. Este método se puede utilizar, por ejemplo, para tratar a un paciente y luego ver visiblemente el resultado del tratamiento. [13]
Los sensores electroquímicos se pueden utilizar para la detección de biomoléculas sin etiquetas. Detectan cambios y miden la corriente entre un electrodo metálico sondado y un electrolito que contiene el analito objetivo. Luego se aplica un potencial conocido al electrodo a partir de una corriente de retroalimentación y se puede medir la corriente resultante. Por ejemplo, una técnica que utiliza detección electroquímica incluye aumentar lentamente el voltaje provocando que las especies químicas en el electrodo se oxiden o reduzcan. Se traza la corriente de la celda frente al voltaje, lo que en última instancia puede identificar la cantidad de especies químicas consumidas o producidas en el electrodo. [14] Las etiquetas fluorescentes se pueden utilizar junto con sensores electroquímicos para facilitar la detección en un sistema biológico.
De los diversos métodos de etiquetado de biomoléculas, los marcadores fluorescentes son ventajosos porque son altamente sensibles incluso a bajas concentraciones y no destructivos para el plegamiento y la función de la molécula objetivo. [1]
La proteína fluorescente verde es una proteína fluorescente natural de la medusa Aequorea victoria que se usa ampliamente para marcar proteínas de interés. GFP emite un fotón en la región verde del espectro de luz cuando se excita por la absorción de luz. El cromóforo consiste en un tripéptido oxidado -Ser^65-Tyr^66-Gly^67 ubicado dentro de un barril β. GFP cataliza la oxidación y solo requiere oxígeno molecular. La GFP se ha modificado cambiando la longitud de onda de la luz absorbida para incluir otros colores de fluorescencia. YFP o proteína fluorescente amarilla , BFP o proteína fluorescente azul y CFP o proteína fluorescente cian son ejemplos de variantes de GFP. Estas variantes se producen mediante ingeniería genética del gen GFP. [15]
También se pueden utilizar sondas fluorescentes sintéticas como etiquetas fluorescentes. Las ventajas de estas etiquetas incluyen un tamaño más pequeño con más variedad de colores. Se pueden utilizar para marcar proteínas de interés de forma más selectiva mediante diversos métodos, incluido el etiquetado basado en el reconocimiento químico, como el uso de etiquetas peptídicas quelantes de metales, y el etiquetado basado en el reconocimiento biológico que utiliza reacciones enzimáticas. [16] Sin embargo, a pesar de su amplia gama de longitudes de onda de excitación y emisión, así como de su mejor estabilidad, las sondas sintéticas tienden a ser tóxicas para las células y, por lo tanto, generalmente no se utilizan en estudios de imágenes celulares. [1]
Las etiquetas fluorescentes se pueden hibridar con ARNm para ayudar a visualizar la interacción y la actividad, como la localización del ARNm. Una cadena antisentido marcada con la sonda fluorescente se une a una única cadena de ARNm y luego se puede observar durante el desarrollo celular para ver el movimiento del ARNm dentro de la célula. [17]
Un fluorógeno es un ligando (ligando fluorogénico) que no es fluorescente en sí mismo, pero que cuando se une a una proteína o estructura de ARN específica se vuelve fluorescente. [18]
Por ejemplo, FAST es una variante de la proteína amarilla fotoactiva que fue diseñada para unirse a imitadores químicos del cromóforo tripéptido GFP. [19] Asimismo, el aptámero de espinaca es una secuencia de ARN diseñada que puede unirse a imitadores químicos del cromóforo de GFP, confiriendo así fluorescencia condicional y reversible a las moléculas de ARN que contienen la secuencia. [20]
El etiquetado fluorescente es conocido por su naturaleza no destructiva y su alta sensibilidad. Esto lo ha convertido en uno de los métodos más utilizados para etiquetar y rastrear biomoléculas. [1] Se pueden utilizar varias técnicas de marcaje fluorescente dependiendo de la naturaleza del objetivo.
En el marcaje enzimático, primero se forma una construcción de ADN utilizando un gen y el ADN de una proteína fluorescente. [21] Después de la transcripción, se forma un híbrido ARN + fluorescente. El objeto de interés está unido a una enzima que puede reconocer este ADN híbrido. Normalmente se utiliza fluoresceína como fluoróforo.
El etiquetado químico o el uso de etiquetas químicas utiliza la interacción entre una molécula pequeña y una secuencia de aminoácidos genética específica. [22] El etiquetado de sustancias químicas se utiliza a veces como alternativa a las buenas prácticas agrarias. Las proteínas sintéticas que funcionan como sondas fluorescentes son más pequeñas que las GFP y, por tanto, pueden funcionar como sondas en una variedad más amplia de situaciones. Además, ofrecen una gama más amplia de colores y propiedades fotoquímicas. [23] Con los avances recientes en el etiquetado químico, las etiquetas químicas se prefieren a las proteínas fluorescentes debido a las limitaciones de arquitectura y tamaño del característico barril β de la proteína fluorescente. Las alteraciones de las proteínas fluorescentes conducirían a la pérdida de propiedades fluorescentes. [22]
El etiquetado de proteínas utiliza una etiqueta corta para minimizar la interrupción del plegamiento y la función de las proteínas. Los metales de transición se utilizan para unir residuos específicos en las etiquetas a objetivos específicos del sitio, como los extremos N, C-terminales o sitios internos dentro de la proteína. Ejemplos de etiquetas utilizadas para el etiquetado de proteínas incluyen etiquetas biarsenicales, etiquetas de histidina y etiquetas FLAG. [1]
La hibridación fluorescente in situ (FISH) es un ejemplo de una técnica de etiquetado genético que utiliza sondas que son específicas para sitios cromosómicos a lo largo de un cromosoma, también conocida como pintura cromosómica . Múltiples tintes fluorescentes, cada uno de los cuales tiene una longitud de onda de excitación y emisión distinta, están unidos a una sonda que luego se hibrida con los cromosomas. Un microscopio de fluorescencia puede detectar los tintes presentes y enviarlos a una computadora que puede revelar el cariotipo de una célula. Esta técnica permite revelar anomalías como eliminaciones y duplicaciones. [24]
Las etiquetas químicas se han adaptado a las tecnologías de imágenes más que a las proteínas fluorescentes porque las etiquetas químicas pueden localizar fotosensibilizadores más cerca de las proteínas objetivo. [25] Las proteínas luego se pueden etiquetar y detectar con imágenes como microscopía de superresolución , imágenes de Ca 2+ , detección de pH, detección de peróxido de hidrógeno, inactivación de luz asistida por cromóforos y microscopía de luz multifotónica. Se han realizado por primera vez estudios de imágenes in vivo en animales vivos con el uso de una proteína monomérica derivada de la haloalcano deshalogenasa bacteriana conocida como Halo-tag. [22] [26] La etiqueta Halo se une covalentemente a su ligando y permite una mejor expresión de proteínas solubles. [26]
Aunque los tintes fluorescentes pueden no tener la misma sensibilidad que las sondas radiactivas, pueden mostrar la actividad de las moléculas en acción en tiempo real. [27] Además, la radiación y el manejo adecuado ya no son una preocupación.
Con el desarrollo del etiquetado fluorescente, la microscopía de fluorescencia ha permitido la visualización de proteínas específicas en imágenes de células tanto fijas como vivas. La localización de proteínas específicas ha dado lugar a conceptos importantes en biología celular, como las funciones de distintos grupos de proteínas en las membranas y orgánulos celulares. En las imágenes de células vivas, las etiquetas fluorescentes permiten controlar los movimientos de las proteínas y sus interacciones. [24]
Los últimos avances en métodos que utilizan etiquetas fluorescentes han llevado a la visualización del ARNm y su localización en varios organismos. Se pueden lograr imágenes de ARN en células vivas introduciendo ARN sintetizado acoplado químicamente con una etiqueta fluorescente en células vivas mediante microinyección. Esta técnica se utilizó para mostrar cómo el ARNm de Oskar en el embrión de Drosophila se localiza en la región posterior del ovocito . [17]
Aquí informamos el desarrollo de informadores de proteínas que generan fluorescencia a partir de moléculas que de otro modo serían oscuras (fluorógenos).