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Diagnóstico molecular

Especialista en el uso de "QIAsymphony", una plataforma de automatización para pruebas de diagnóstico molecular

El diagnóstico molecular es un conjunto de técnicas que se utilizan para analizar marcadores biológicos en el genoma y el proteoma , y ​​cómo sus células expresan sus genes como proteínas , aplicando la biología molecular a las pruebas médicas . En medicina, la técnica se utiliza para diagnosticar y controlar enfermedades, detectar riesgos y decidir qué terapias funcionarán mejor para pacientes individuales, [1] [2] : prólogo  y en bioseguridad agrícola de manera similar para controlar enfermedades de cultivos y ganado , estimar riesgos y decidir qué medidas de cuarentena deben tomarse. [3]

Al analizar las características específicas del paciente y su enfermedad, el diagnóstico molecular ofrece la perspectiva de una medicina personalizada . [4] Estas pruebas son útiles en una variedad de especialidades médicas , incluidas las enfermedades infecciosas , la oncología , la tipificación del antígeno leucocitario humano (que investiga y predice la función inmunológica ), la coagulación y la farmacogenómica , la predicción genética de qué medicamentos funcionarán mejor. [5] : v-vii  Se superponen con la química clínica (pruebas médicas en fluidos corporales).

Historia

El diagnóstico molecular utiliza técnicas como la espectrometría de masas y los chips genéticos para capturar los patrones de expresión de genes y proteínas.

El campo de la biología molecular creció a finales del siglo XX, al igual que su aplicación clínica. En 1980, Yuet Wai Kan et al . propusieron una prueba genética prenatal para la talasemia que no dependía de la secuenciación del ADN (entonces en sus inicios), sino de enzimas de restricción que cortaban el ADN donde reconocían secuencias cortas específicas, creando diferentes longitudes de cadena de ADN dependiendo del alelo (variación genética) que poseía el feto. [6] En la década de 1980, la frase se utilizó en los nombres de empresas como Molecular Diagnostics Incorporated [7] y Bethseda Research Laboratories Molecular Diagnostics . [8] [9]

Durante la década de 1990, la identificación de genes recién descubiertos y nuevas técnicas para la secuenciación del ADN llevaron a la aparición de un campo distinto de medicina molecular y genómica de laboratorio; en 1995, se formó la Asociación de Patología Molecular (AMP) para darle estructura. En 1999, la AMP cofundó The Journal of Medical Diagnostics . [10] Informa Healthcare lanzó Expert Reviews in Medical Diagnostics en 2001. [1] A partir de 2002, el Proyecto HapMap agregó información sobre las diferencias genéticas de una letra que se repiten en la población humana (los polimorfismos de un solo nucleótido ) y su relación con la enfermedad. [2] : cap 37  En 2012, las técnicas de diagnóstico molecular para la talasemia utilizan pruebas de hibridación genética para identificar el polimorfismo de un solo nucleótido específico que causa la enfermedad de un individuo. [11]

A medida que la aplicación comercial de los diagnósticos moleculares ha cobrado mayor importancia, también lo ha hecho el debate sobre las patentes de los descubrimientos genéticos que los sustentan . En 1998, la Directiva 98/44/EC de la Unión Europea aclaró que las patentes sobre secuencias de ADN eran admisibles. [12] En 2010, en los EE. UU., AMP demandó a Myriad Genetics para impugnar las patentes de esta última con respecto a dos genes, BRCA1 y BRCA2 , que están asociados con el cáncer de mama. En 2013, la Corte Suprema de los EE. UU. estuvo parcialmente de acuerdo y dictaminó que una secuencia genética natural no podía patentarse. [13] [14]

Técnicas

El Affymetrix 5.0, un chip de microarrays

Desarrollo de herramientas de investigación

La industrialización de las herramientas de análisis de biología molecular ha hecho que sea práctico utilizarlas en las clínicas. [2] : prólogo  La miniaturización en un único dispositivo portátil puede llevar los diagnósticos médicos a la clínica, la oficina o el hogar. [2] : prólogo  El laboratorio clínico requiere altos estándares de confiabilidad; los diagnósticos pueden requerir acreditación o estar sujetos a las regulaciones de los dispositivos médicos. [15] A partir de 2011 , algunos laboratorios clínicos de EE. UU. seguían utilizando ensayos vendidos solo para "uso de investigación". [16]

Los procesos de laboratorio deben cumplir con las regulaciones, como las Enmiendas para la Mejora de los Laboratorios Clínicos , la Ley de Portabilidad y Responsabilidad del Seguro Médico , las Buenas Prácticas de Laboratorio y las especificaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos. Los sistemas de gestión de información de laboratorio ayudan a realizar un seguimiento de estos procesos. [17] La ​​regulación se aplica tanto al personal como a los suministros. A partir de 2012 , doce estados de EE. UU. requieren que los patólogos moleculares tengan licencia; varias juntas, como la Junta Estadounidense de Genética Médica y la Junta Estadounidense de Patología, certifican a los tecnólogos, supervisores y directores de laboratorio. [18]

La automatización y la codificación de muestras maximizan el rendimiento y reducen la posibilidad de error o contaminación durante la manipulación manual y la presentación de resultados. Ahora hay dispositivos individuales disponibles para realizar el análisis de principio a fin. [15]

Ensayos

El diagnóstico molecular utiliza ensayos biológicos in vitro como PCR- ELISA o hibridación in situ con fluorescencia . [19] [20] El ensayo detecta una molécula, a menudo en bajas concentraciones, que es un marcador de enfermedad o riesgo en una muestra tomada de un paciente. La conservación de la muestra antes del análisis es fundamental. La manipulación manual debe minimizarse. [21] La frágil molécula de ARN plantea ciertos desafíos. Como parte del proceso celular de expresión de genes como proteínas, ofrece una medida de la expresión genética, pero es vulnerable a la hidrólisis y la descomposición por las enzimas ARNasas siempre presentes . Las muestras se pueden congelar rápidamente en nitrógeno líquido o incubar en agentes de conservación. [2] : cap 39 

Debido a que los métodos de diagnóstico molecular pueden detectar marcadores sensibles, estas pruebas son menos invasivas que una biopsia tradicional . Por ejemplo, debido a que los ácidos nucleicos libres de células existen en el plasma humano , una simple muestra de sangre puede ser suficiente para tomar muestras de información genética de tumores, trasplantes o un feto no nacido. [2] : cap 45  Muchos, pero no todos, los métodos de diagnóstico molecular basados ​​en la detección de ácidos nucleicos utilizan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aumentar enormemente el número de moléculas de ácido nucleico, amplificando así la(s) secuencia(s) objetivo en la muestra del paciente. [2] : prólogo  La PCR es un método en el que se amplifica un ADN molde utilizando cebadores sintéticos, una ADN polimerasa y dNTP. La mezcla se cicla entre al menos 2 temperaturas: una temperatura alta para desnaturalizar el ADN bicatenario en moléculas monocatenarias y una temperatura baja para que el cebador se hibride con el molde y para que la polimerasa extienda el cebador. Cada ciclo de temperatura duplica teóricamente la cantidad de secuencia objetivo. La detección de variaciones de secuencia mediante PCR generalmente implica el diseño y uso de reactivos de oligonucleótidos que amplifican la variante de interés de manera más eficiente que la secuencia de tipo salvaje. La PCR es actualmente el método más utilizado para la detección de secuencias de ADN. [22] La detección del marcador puede utilizar PCR en tiempo real, secuenciación directa, [2] : chips de microarrays de ch 17  (chips prefabricados que prueban muchos marcadores a la vez), [2] : ch 24  o MALDI-TOF [23] El mismo principio se aplica al proteoma y al genoma . Los arreglos de proteínas de alto rendimiento pueden usar ADN complementario o anticuerpos para unirse y, por lo tanto, pueden detectar muchas proteínas diferentes en paralelo. [24] Las pruebas de diagnóstico molecular varían ampliamente en sensibilidad, tiempo de respuesta, costo, cobertura y aprobación regulatoria. También varían en el nivel de validación aplicado en los laboratorios que las utilizan. Por lo tanto, se requiere una validación local sólida de acuerdo con los requisitos regulatorios y el uso de controles apropiados, especialmente cuando el resultado puede usarse para informar una decisión de tratamiento del paciente. [25]

Beneficios

Un chip de microarray contiene ADN complementario (ADNc) a muchas secuencias de interés. El ADNc emite fluorescencia cuando se hibrida con un fragmento de ADN coincidente en la muestra.

Prenatal

Las pruebas prenatales convencionales para detectar anomalías cromosómicas , como el síndrome de Down, se basan en el análisis del número y la apariencia de los cromosomas (el cariotipo) . Las pruebas de diagnóstico molecular, como la hibridación genómica comparativa por microarrays , analizan una muestra de ADN y, debido al ADN libre de células en el plasma, podrían ser menos invasivas, pero a fecha de 2013 siguen siendo un complemento de las pruebas convencionales. [26]

Tratamiento

Algunos de los polimorfismos de un solo nucleótido de un paciente (ligeras diferencias en su ADN) pueden ayudar a predecir la rapidez con la que metabolizará determinados fármacos; esto se denomina farmacogenómica . [27] Por ejemplo, la enzima CYP2C19 metaboliza varios fármacos, como el agente anticoagulante Clopidogrel , en sus formas activas. Algunos pacientes poseen polimorfismos en lugares específicos del gen 2C19 que los convierten en metabolizadores deficientes de esos fármacos; los médicos pueden realizar pruebas para detectar estos polimorfismos y averiguar si los fármacos serán totalmente eficaces para ese paciente. [28] Los avances en biología molecular han ayudado a demostrar que algunos síndromes que antes se clasificaban como una sola enfermedad son en realidad múltiples subtipos con causas y tratamientos completamente diferentes. Los diagnósticos moleculares pueden ayudar a diagnosticar el subtipo (por ejemplo, infecciones y cánceres) o el análisis genético de una enfermedad con un componente hereditario, como el síndrome de Silver-Russell . [1] [29]

Enfermedad infecciosa

Los diagnósticos moleculares se utilizan para identificar enfermedades infecciosas como la clamidia , [30] el virus de la gripe [31] y la tuberculosis ; [32] o cepas específicas como el virus H1N1 [33] o el SARS-CoV-2 . [34] La identificación genética puede ser rápida; por ejemplo, una prueba de amplificación isotérmica mediada por bucle diagnostica el parásito de la malaria y es lo suficientemente resistente para los países en desarrollo. [35] Pero a pesar de estos avances en el análisis del genoma, en 2013 las infecciones todavía se identifican con mayor frecuencia por otros medios: su proteoma, bacteriófago o perfil cromatográfico . [36] Los diagnósticos moleculares también se utilizan para comprender la cepa específica del patógeno, por ejemplo, detectando qué genes de resistencia a los medicamentos posee, y, por lo tanto, qué terapias evitar. [37] [36] Además, se pueden implementar ensayos basados ​​​​en la secuenciación metagenómica de próxima generación para identificar organismos patógenos sin sesgo. [38]

Gestión del riesgo de enfermedades

El genoma de un paciente puede incluir una mutación hereditaria o aleatoria que afecta la probabilidad de desarrollar una enfermedad en el futuro. [27] Por ejemplo, el síndrome de Lynch es una enfermedad genética que predispone a los pacientes al cáncer colorrectal y otros cánceres; la detección temprana puede conducir a un seguimiento cercano que mejora las posibilidades del paciente de un buen resultado. [39] El riesgo cardiovascular está indicado por marcadores biológicos y la detección puede medir el riesgo de que un niño nazca con una enfermedad genética como la fibrosis quística . [40] Las pruebas genéticas son éticamente complejas: los pacientes pueden no querer el estrés de conocer su riesgo. [41] En países sin atención médica universal, un riesgo conocido puede aumentar las primas de seguro. [42]

Cáncer

El cáncer es un cambio en los procesos celulares que hacen que un tumor crezca sin control. [27] Las células cancerosas a veces tienen mutaciones en oncogenes , como KRAS y CTNNB1 (β-catenina). [43] El análisis de la firma molecular de las células cancerosas (el ADN y sus niveles de expresión a través del ARN mensajero) permite a los médicos caracterizar el cáncer y elegir la mejor terapia para sus pacientes. [27] A partir de 2010, los ensayos que incorporan una serie de anticuerpos contra moléculas marcadoras de proteínas específicas son una tecnología emergente; hay esperanzas para estos ensayos multiplex que podrían medir muchos marcadores a la vez. [44] Otros posibles biomarcadores futuros incluyen moléculas de micro ARN , que las células cancerosas expresan más que las sanas. [45]

El cáncer es una enfermedad con causas moleculares excesivas y una evolución constante. También existe heterogeneidad de la enfermedad incluso en un individuo. Los estudios moleculares del cáncer han demostrado la importancia de las mutaciones impulsoras en el crecimiento y la metástasis de los tumores. [46] Se han desarrollado muchas tecnologías para la detección de variaciones de secuencia para la investigación del cáncer. Estas tecnologías generalmente se pueden agrupar en tres enfoques: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hibridación y secuenciación de próxima generación (NGS). [22] Actualmente, la FDA ha aprobado muchos ensayos de PCR e hibridación como diagnósticos in vitro. [47] Sin embargo, los ensayos de NGS aún se encuentran en una etapa temprana en el diagnóstico clínico. [48]

Para realizar el diagnóstico molecular del cáncer, uno de los aspectos más importantes es la detección de variaciones en la secuencia de ADN. Las muestras de biopsia tumoral utilizadas para el diagnóstico siempre contienen tan solo un 5 % de la variante deseada en comparación con la secuencia de tipo salvaje. Además, para aplicaciones no invasivas a partir de sangre periférica u orina, la prueba de ADN debe ser lo suficientemente específica para detectar mutaciones con frecuencias de alelos variantes inferiores al 0,1 %. [22]

Actualmente, mediante la optimización de la PCR tradicional, existe una nueva invención, el sistema de mutación refractaria a la amplificación (ARMS), un método para detectar variantes de la secuencia de ADN en el cáncer. El principio detrás del ARMS es que la actividad de extensión enzimática de las polimerasas de ADN es altamente sensible a los desajustes cerca del extremo 3' del cebador. [22] Muchas empresas diferentes han desarrollado pruebas de diagnóstico basadas en cebadores de PCR ARMS. Por ejemplo, Qiagen therascreen, [49] Roche cobas [50] y Biomerieux THxID [51] han desarrollado pruebas de PCR aprobadas por la FDA para detectar mutaciones de cáncer de pulmón, colon y melanoma metastásico en los genes KRAS, EGFR y BRAF. Sus kits de IVD se validaron básicamente en ADN genómico extraído de tejido FFPE.

También existen microarrays que utilizan el mecanismo de hibridación para diagnosticar el cáncer. Se pueden sintetizar más de un millón de sondas diferentes en un array con la tecnología Genechip de Affymetrix con un límite de detección de una a diez copias de ARNm por pocillo. [22] Normalmente se considera que los microarrays optimizados producen una cuantificación relativa repetible de diferentes objetivos. [52] Actualmente, la FDA ya ha aprobado una serie de ensayos de diagnóstico que utilizan microarrays: los ensayos MammaPrint de Agendia pueden informar sobre el riesgo de recurrencia del cáncer de mama al perfilar la expresión de 70 genes relacionados con el cáncer de mama; [53] el ensayo INFNITI CYP2C19 de Autogenomics puede perfilar polimorfismos genéticos, cuyos impactos en la respuesta terapéutica a los antidepresivos son grandes; [54] y CytoScan Dx de Affymetrix puede evaluar discapacidades intelectuales y trastornos congénitos al analizar la mutación cromosómica. [55]

En el futuro, las herramientas de diagnóstico del cáncer probablemente se centrarán en la secuenciación de nueva generación (NGS). Al utilizar la secuenciación de ADN y ARN para realizar diagnósticos del cáncer, la tecnología en el campo de las herramientas de diagnóstico molecular se desarrollará mejor. Aunque el rendimiento y el precio de la NGS se han reducido drásticamente en los últimos 10 años en aproximadamente 100 veces, seguimos estando al menos a 6 órdenes de magnitud de realizar una secuenciación profunda a nivel de todo el genoma. [22] Actualmente, Ion Torrent desarrolló algunos paneles de NGS basados ​​en AmpliSeq translacional, por ejemplo, el Oncomine Comprehensive Assay. [56] Se están centrando en utilizar la secuenciación profunda de genes relacionados con el cáncer para detectar variantes de secuencia raras.

Las herramientas de diagnóstico molecular se pueden utilizar para la evaluación del riesgo de cáncer. Por ejemplo, la prueba BRCA1/2 de Myriad Genetics evalúa el riesgo de cáncer de mama de por vida en las mujeres. [22] Además, algunos cánceres no siempre se emplean con síntomas claros. Es útil analizar a las personas cuando no muestran síntomas obvios y, por lo tanto, se puede detectar el cáncer en etapas tempranas. Por ejemplo, la prueba ColoGuard se puede utilizar para detectar el cáncer colorrectal en personas mayores de 55 años . [57] El cáncer es una enfermedad a largo plazo con varios pasos de progresión, las herramientas de diagnóstico molecular se pueden utilizar para el pronóstico de la progresión del cáncer. Por ejemplo, la prueba OncoType Dx de Genomic Health puede estimar el riesgo de cáncer de mama. Su tecnología puede informar a los pacientes que busquen quimioterapia cuando sea necesario al examinar los niveles de expresión de ARN en el tejido de la biopsia de cáncer de mama. [58]

Con el creciente apoyo gubernamental al diagnóstico molecular del ADN, se espera que pronto haya cada vez más ensayos clínicos de detección de ADN para el cáncer disponibles. Actualmente, la investigación en el diagnóstico del cáncer está avanzando rápidamente con el objetivo de lograr menores costos, menor consumo de tiempo y métodos más simples para los médicos y los pacientes.

Véase también

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