Un cebador es un ácido nucleico monocatenario corto utilizado por todos los organismos vivos en el inicio de la síntesis de ADN . Un cebador sintético también puede denominarse oligo , abreviatura de oligonucleótido. Las enzimas ADN polimerasa (responsables de la replicación del ADN) solo son capaces de agregar nucleótidos al extremo 3' de un ácido nucleico existente, lo que requiere que se una un cebador a la plantilla antes de que la ADN polimerasa pueda comenzar una cadena complementaria. [1] La ADN polimerasa agrega nucleótidos después de unirse al cebador de ARN y sintetiza la cadena completa. Posteriormente, las hebras de ARN deben eliminarse con precisión y reemplazarlas con nucleótidos de ADN formando una región hueco conocida como mella que se rellena utilizando una enzima llamada ligasa. [2] El proceso de eliminación del cebador de ARN requiere varias enzimas, como Fen1, Lig1 y otras que trabajan en coordinación con la ADN polimerasa, para asegurar la eliminación de los nucleótidos de ARN y la adición de nucleótidos de ADN. Los organismos vivos utilizan únicamente cebadores de ARN, mientras que las técnicas de laboratorio en bioquímica y biología molecular que requieren síntesis de ADN in vitro (como la secuenciación de ADN y la reacción en cadena de la polimerasa ) suelen utilizar cebadores de ADN, ya que son más estables a la temperatura. Los cebadores se pueden diseñar en el laboratorio para reacciones específicas como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Al diseñar cebadores de PCR, hay medidas específicas que se deben tener en cuenta, como la temperatura de fusión de los cebadores y la temperatura de hibridación de la propia reacción. Además, la secuencia de unión al ADN del cebador in vitro debe elegirse específicamente, lo que se realiza mediante un método llamado herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST, por sus siglas en inglés) que escanea el ADN y encuentra regiones específicas y únicas para que se una el cebador.
Los organismos vivos utilizan cebadores de ARN al iniciar la síntesis de una cadena de ADN . Una clase de enzimas llamadas primasas añaden un cebador de ARN complementario a la plantilla de lectura de novo tanto en la cadena principal como en la rezagada . A partir del 3'-OH libre del cebador, conocido como extremo del cebador, una ADN polimerasa puede extender una cadena recién sintetizada. La cadena líder en la replicación del ADN se sintetiza en una pieza continua que se mueve con la horquilla de replicación , y solo requiere un cebador de ARN inicial para comenzar la síntesis. En la cadena retrasada, el ADN molde corre en la dirección 5′→3′ . Dado que la ADN polimerasa no puede agregar bases en la dirección 3′→5′ complementaria a la cadena plantilla, el ADN se sintetiza "hacia atrás" en fragmentos cortos que se alejan de la horquilla de replicación, conocidos como fragmentos de Okazaki . A diferencia de la cadena principal, este método da como resultado el inicio y la detención repetidos de la síntesis de ADN, lo que requiere múltiples cebadores de ARN. A lo largo de la plantilla de ADN, la primasa intercala cebadores de ARN que la ADN polimerasa utiliza para sintetizar ADN en la dirección 5′→3′. [1]
Otro ejemplo de cebadores que se utilizan para permitir la síntesis de ADN es la transcripción inversa . La transcriptasa inversa es una enzima que utiliza una cadena molde de ARN para sintetizar una cadena complementaria de ADN. El componente ADN polimerasa de la transcriptasa inversa requiere un extremo 3' existente para comenzar la síntesis. [1]
Después de la inserción de los fragmentos de Okazaki , los cebadores de ARN se eliminan (el mecanismo de eliminación difiere entre procariotas y eucariotas ) y se reemplazan con nuevos desoxirribonucleótidos que llenan los huecos donde estaba presente el cebador de ARN. Luego, la ADN ligasa une las hebras fragmentadas, completando la síntesis de la hebra rezagada. [1]
En procariotas, la ADN polimerasa I sintetiza el fragmento de Okazaki hasta llegar al cebador de ARN anterior. Luego, la enzima actúa simultáneamente como una exonucleasa 5′→3′ , eliminando los ribonucleótidos cebadores delante y añadiendo desoxirribonucleótidos detrás. Tanto la actividad de polimerización como la escisión del cebador de ARN ocurren en la dirección 5′→3′ , y la polimerasa I puede realizar estas actividades simultáneamente; esto se conoce como "Traducción de Nick". [3] La traducción de Nick se refiere a la actividad sincronizada de la polimerasa I al eliminar el cebador de ARN y agregar desoxirribonucleótidos . Posteriormente, se forma un espacio entre las hebras llamado mella, que se sella mediante una ADN ligasa .
En eucariotas, la eliminación de los cebadores de ARN en la cadena retrasada es esencial para completar la replicación. Por lo tanto, a medida que la cadena rezagada es sintetizada por la ADN polimerasa δ en la dirección 5'→3' , se forman fragmentos de Okazaki , que son hebras discontinuas de ADN. Luego, cuando la ADN polimerasa llega al extremo 5' del cebador de ARN del fragmento de Okazaki anterior, desplaza el extremo 5' del cebador hacia un colgajo de ARN monocatenario que se elimina mediante escisión con nucleasa. La escisión de las solapas de ARN implica tres métodos de eliminación del cebador. [4] La primera posibilidad de eliminación del cebador es mediante la creación de un colgajo corto que se elimina directamente mediante la endonucleasa 1 específica de la estructura del colgajo (FEN-1), que escinde el colgajo 5' que sobresale. Este método se conoce como vía de solapa corta para la eliminación del cebador de ARN. [5] La segunda forma de escindir un cebador de ARN es degradando la cadena de ARN utilizando una RNasa , en eucariotas se conoce como RNasa H2. Esta enzima degrada la mayor parte del cebador de ARN hibridado, excepto los nucleótidos cercanos al extremo 5' del cebador. Por lo tanto, los nucleótidos restantes se muestran en un colgajo que se escinde usando FEN-1. El último método posible para eliminar el cebador de ARN se conoce como vía de solapa larga. [5] En esta vía se reclutan varias enzimas para alargar el cebador de ARN y luego escindirlo. Las aletas se alargan mediante una helicasa de 5' a 3' , conocida como Pif1 . Después de la adición de nucleótidos al colgajo mediante Pif1, el colgajo largo se estabiliza mediante la proteína de replicación A (RPA). El ADN unido a RPA inhibe la actividad o el reclutamiento de FEN1, como resultado se debe reclutar otra nucleasa para escindir el colgajo. [4] Esta segunda nucleasa es la nucleasa DNA2 , que tiene una actividad helicasa-nucleasa, que escinde el largo ala del cebador de ARN, que luego deja un par de nucleótidos que son escindidos por FEN1. Al final, cuando se han eliminado todos los cebadores de ARN, se forman mellas entre los fragmentos de Okazaki que se rellenan con desoxirribonucleótidos mediante una enzima conocida como ligasa1 , mediante un proceso llamado ligación .
Los cebadores sintéticos, a veces conocidos como oligonucleótidos, son oligonucleótidos sintetizados químicamente , generalmente de ADN, que pueden personalizarse para hibridarse con un sitio específico en el ADN molde. En solución, el cebador se hibrida espontáneamente con la plantilla mediante el emparejamiento de bases de Watson-Crick antes de ser extendido por la ADN polimerasa. La capacidad de crear y personalizar cebadores sintéticos ha demostrado ser una herramienta invaluable necesaria para una variedad de enfoques de biología molecular que involucran el análisis de ADN. Tanto el método de terminación de cadena de Sanger como el método de secuenciación de ADN “ Next-Gen ” requieren cebadores para iniciar la reacción. [1]
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utiliza un par de cebadores personalizados para dirigir el alargamiento del ADN entre sí en los extremos opuestos de la secuencia que se amplifica. Estos cebadores suelen tener entre 18 y 24 bases de longitud y deben codificar únicamente los sitios específicos aguas arriba y aguas abajo de la secuencia que se está amplificando. Un cebador que pueda unirse a múltiples regiones del ADN las amplificará todas, eliminando el propósito de la PCR. [1]
Se deben tener en cuenta algunos criterios al diseñar un par de cebadores de PCR. Los pares de cebadores deben tener temperaturas de fusión similares, ya que la hibridación durante la PCR ocurre para ambas hebras simultáneamente, y esta temperatura de fusión compartida no debe ser mucho mayor o menor que la temperatura de hibridación de la reacción . Un cebador con una Tm (temperatura de fusión) mucho más alta que la temperatura de hibridación de la reacción puede hibridarse incorrectamente y extenderse en una ubicación incorrecta a lo largo de la secuencia de ADN . Una Tm significativamente menor que la temperatura de recocido puede no lograr recocido ni extenderse en absoluto.
Además, es necesario elegir secuencias de cebadores para seleccionar de forma única una región de ADN, evitando la posibilidad de hibridación con una secuencia similar cercana. Un método comúnmente utilizado para seleccionar un sitio de cebador es la búsqueda BLAST , mediante la cual se pueden ver todas las regiones posibles a las que se puede unir un cebador. Tanto la secuencia de nucleótidos como el propio cebador se pueden buscar mediante BLAST. La herramienta gratuita NCBI Primer-BLAST integra el diseño de cebadores y la búsqueda BLAST en una sola aplicación, [6] al igual que productos de software comerciales como ePrime y Beacon Designer . Se pueden realizar simulaciones por computadora de los resultados teóricos de la PCR ( PCR electrónica ) para ayudar en el diseño del cebador proporcionando temperaturas de fusión y recocido, etc. [7]
A partir de 2014, hay muchas herramientas en línea disponibles gratuitamente para el diseño de cebadores, algunas de las cuales se centran en aplicaciones específicas de la PCR. Los cebadores con alta especificidad para un subconjunto de plantillas de ADN en presencia de muchas variantes similares pueden diseñarse mediante algún software (por ejemplo, DECIPHER [8] ) o desarrollarse de forma independiente para un grupo específico de animales. [9]
La selección de una región específica del ADN para la unión del cebador requiere algunas consideraciones adicionales. Deben evitarse las regiones con alto contenido de repeticiones de mononucleótidos y dinucleótidos, ya que puede producirse la formación de bucles y contribuir a una mala hibridación. Los imprimadores no deben mezclarse fácilmente con otros imprimadores de la mezcla; Este fenómeno puede conducir a la producción de productos de 'dímeros de cebador' que contaminan la solución final. Los cebadores tampoco deben aparearse fuertemente entre sí, ya que las horquillas y los bucles internos podrían dificultar el apareamiento con el ADN molde.
Al diseñar cebadores, se pueden agregar bases de nucleótidos adicionales a los extremos posteriores de cada cebador, lo que da como resultado una secuencia de tapa personalizada en cada extremo de la región amplificada. Una aplicación de esta práctica es su uso en la clonación TA , una técnica de subclonación especial similar a la PCR, donde la eficiencia se puede aumentar agregando colas AG a los extremos 5' y 3'. [10]
Algunas situaciones pueden requerir el uso de cebadores degenerados. Se trata de mezclas de cebadores similares, pero no idénticos. Estos pueden resultar convenientes al amplificar el mismo gen de diferentes organismos , ya que las secuencias probablemente sean similares pero no idénticas. Esta técnica es útil porque el código genético en sí está degenerado , lo que significa que varios codones diferentes pueden codificar el mismo aminoácido . Esto permite que diferentes organismos tengan una secuencia genética significativamente diferente que codifica una proteína muy similar. Por esta razón, los cebadores degenerados también se utilizan cuando el diseño del cebador se basa en la secuencia de proteínas , ya que no se conoce la secuencia específica de codones. Por lo tanto, la secuencia del cebador correspondiente al aminoácido isoleucina podría ser "ATH", donde A representa adenina , T para timina y H para adenina , timina o citosina , según el código genético de cada codón , utilizando los símbolos IUPAC para bases degeneradas . Es posible que los cebadores degenerados no se hibriden perfectamente con una secuencia diana, lo que puede reducir en gran medida la especificidad de la amplificación por PCR.
Los cebadores degenerados se utilizan ampliamente y son extremadamente útiles en el campo de la ecología microbiana . Permiten la amplificación de genes de microorganismos hasta ahora no cultivados o permiten la recuperación de genes de organismos donde la información genómica no está disponible. Por lo general, los cebadores degenerados se diseñan alineando la secuenciación de genes que se encuentran en GenBank . Las diferencias entre secuencias se explican mediante el uso de degeneraciones IUPAC para bases individuales. A continuación, los cebadores de PCR se sintetizan como una mezcla de cebadores correspondientes a todas las permutaciones de la secuencia de codones.
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