La glicosilación ligada a N es la unión de un oligosacárido , un carbohidrato que consta de varias moléculas de azúcar, a veces también denominado glicano , a un átomo de nitrógeno (el nitrógeno amida de un residuo de asparagina (Asn) de una proteína ), en un proceso llamada N -glicosilación , estudiada en bioquímica . [1] La proteína resultante se llama glicano unido a N , o simplemente N-glicano .
Este tipo de enlace es importante tanto para la estructura [2] como para la función [3] de muchas proteínas eucariotas. El proceso de glicosilación ligada a N ocurre en eucariotas y ampliamente en arqueas , pero muy raramente en bacterias . La naturaleza de los glicanos unidos a N unidos a una glicoproteína está determinada por la proteína y la célula en la que se expresa. [4] También varía según la especie . Diferentes especies sintetizan diferentes tipos de glucano ligado a N.
Hay dos tipos de enlaces involucrados en una glicoproteína: enlaces entre los residuos de sacáridos en el glicano y el enlace entre la cadena de glicano y la molécula de proteína.
Los restos de azúcar están unidos entre sí en la cadena de glicano mediante enlaces glicosídicos . Estos enlaces normalmente se forman entre los carbonos 1 y 4 de las moléculas de azúcar. La formación del enlace glicosídico es energéticamente desfavorable, por lo que la reacción está acoplada a la hidrólisis de dos moléculas de ATP . [4]
Por otro lado, la unión de un residuo de glicano a una proteína requiere el reconocimiento de una secuencia consenso . Los glicanos unidos a N casi siempre están unidos al átomo de nitrógeno de una cadena lateral de asparagina (Asn) que está presente como parte de la secuencia consenso Asn-X- Ser / Thr , donde X es cualquier aminoácido excepto prolina (Pro). [4]
En las células animales, el glicano unido a la asparagina es casi inevitablemente N -acetilglucosamina (GlcNAc) en la configuración β. [4] Este enlace β es similar al enlace glicosídico entre los restos de azúcar en la estructura de glicano como se describe anteriormente. En lugar de estar unido a un grupo hidroxilo de azúcar , el átomo de carbono anomérico está unido a una amida de nitrógeno. La energía necesaria para este enlace proviene de la hidrólisis de una molécula de pirofosfato . [4]
La biosíntesis de glicanos unidos a N se produce mediante 3 pasos principales: [4]
La síntesis, la transferencia en bloque y el recorte inicial del oligosacárido precursor se producen en el retículo endoplásmico (RE). El posterior procesamiento y modificación de la cadena de oligosacáridos se lleva a cabo en el aparato de Golgi .
De este modo, la síntesis de glicoproteínas está espacialmente separada en diferentes compartimentos celulares. Por tanto, el tipo de N -glucano sintetizado depende de su accesibilidad a las diferentes enzimas presentes dentro de estos compartimentos celulares.
Sin embargo, a pesar de la diversidad, todos los N -glicanos se sintetizan a través de una vía común con una estructura de glicano central común. [4] La estructura central de glicano está compuesta esencialmente por dos residuos de N -acetil glucosamina y tres residuos de manosa . Este glicano central luego se elabora y modifica aún más, lo que da como resultado una amplia gama de estructuras de N -glicano. [4]
El proceso de glicosilación ligada a N comienza con la formación de azúcar GlcNAc ligada a dolicol . Dolichol es una molécula lipídica compuesta de unidades repetidas de isopreno . Esta molécula se encuentra adherida a la membrana del RE. Las moléculas de azúcar están unidas al dolicol a través de un enlace pirofosfato [4] (un fosfato estaba originalmente unido al dolicol y el segundo fosfato provino del azúcar nucleótido ). Luego, la cadena de oligosacárido se extiende mediante la adición de varias moléculas de azúcar de forma gradual para formar un oligosacárido precursor.
El ensamblaje de este oligosacárido precursor se produce en dos fases: Fase I y II. [4] La Fase I tiene lugar en el lado citoplasmático del RE y la Fase II tiene lugar en el lado luminal del RE.
La molécula precursora, lista para ser transferida a una proteína, consta de 2 moléculas de GlcNAc, 9 de manosa y 3 de glucosa .
Una vez que se forma el oligosacárido precursor, el glicano completo se transfiere al polipéptido naciente en la luz de la membrana del RE. Esta reacción es impulsada por la energía liberada por la ruptura del enlace pirofosfato entre la molécula de dolicol-glicano. Hay tres condiciones que deben cumplirse antes de que un glucano se transfiera a un polipéptido naciente: [4]
La oligosacariltransferasa es la enzima responsable del reconocimiento de la secuencia consenso y la transferencia del glicano precursor a un polipéptido aceptor que se traduce en la luz del retículo endoplásmico. La glicosilación ligada a N es, por lo tanto, un evento cotraduccional
El procesamiento de N -glicano se lleva a cabo en el retículo endoplásmico y el cuerpo de Golgi. El recorte inicial de la molécula precursora se produce en el RE y el procesamiento posterior se produce en el Golgi.
Al transferir el glicano completo al polipéptido naciente, se eliminan dos residuos de glucosa de la estructura. Las enzimas conocidas como glicosidasas eliminan algunos residuos de azúcar. Estas enzimas pueden romper los enlaces glicosídicos utilizando una molécula de agua. Estas enzimas son exoglicosidasas ya que solo actúan sobre los residuos de monosacáridos ubicados en el extremo no reductor del glicano. [4] Se cree que este paso de recorte inicial actúa como un paso de control de calidad en la sala de emergencias para monitorear el plegamiento de proteínas .
Una vez que la proteína se pliega correctamente, las glucosidasas I y II eliminan dos residuos de glucosa . La eliminación del último tercer residuo de glucosa indica que la glicoproteína está lista para el tránsito desde el RE al cis -Golgi. [4] La manosidasa ER cataliza la eliminación de esta glucosa final. Sin embargo, si la proteína no se pliega correctamente, los residuos de glucosa no se eliminan y, por tanto, la glicoproteína no puede salir del retículo endoplásmico. Una proteína chaperona ( calnexina / calreticulina ) se une a la proteína desplegada o parcialmente plegada para ayudar al plegamiento de la proteína.
El siguiente paso implica una mayor adición y eliminación de residuos de azúcar en el cis-Golgi. Estas modificaciones están catalizadas por glicosiltransferasas y glicosidasas respectivamente. En cis -Golgi, una serie de manosidasas eliminan algunos o todos los cuatro residuos de manosa en los enlaces α-1,2. [4] Mientras que en la porción medial del Golgi, las glicosiltransferasas añaden residuos de azúcar a la estructura central de glucanos, dando lugar a los tres tipos principales de glucanos: glicanos con alto contenido de manosa, híbridos y complejos.
El orden de adición de azúcares a las cadenas de glucanos en crecimiento está determinado por las especificidades de sustrato de las enzimas y su acceso al sustrato a medida que avanzan a través de la vía secretora . Por tanto, la organización de esta maquinaria dentro de una célula juega un papel importante a la hora de determinar qué glicanos se producen.
Las enzimas de Golgi desempeñan un papel clave en la determinación de la síntesis de los distintos tipos de glicanos. El orden de acción de las enzimas se refleja en su posición en el aparato de Golgi:
Se han encontrado vías de biosíntesis de N -glicanos similares en procariotas y Archaea. [6] Sin embargo, en comparación con los eucariotas, la estructura final de glucano en eubacterias y arqueas no parece diferir mucho del precursor inicial elaborado en el retículo endoplásmico. En los eucariotas, el oligosacárido precursor original se modifica ampliamente en el camino hacia la superficie celular. [4]
Los glicanos unidos a N tienen funciones intrínsecas y extrínsecas. [4] [7]
Dentro del sistema inmunológico, los glicanos unidos a N en la superficie de una célula inmune ayudarán a dictar ese patrón de migración de la célula; por ejemplo, las células inmunes que migran a la piel tienen glicosilaciones específicas que favorecen su localización en ese sitio. [8] Los patrones de glicosilación de las diversas inmunoglobulinas, incluidas IgE, IgM, IgD, IgA e IgG, les confieren funciones efectoras únicas al alterar sus afinidades por Fc y otros receptores inmunitarios. [8] Los glicanos también pueden estar involucrados en la discriminación "propio" y "no propio", lo que puede ser relevante para la fisiopatología de diversas enfermedades autoinmunes. [8]
En algunos casos, la interacción entre el N-glicano y la proteína estabiliza la proteína mediante efectos electrónicos complejos. [11]
Los cambios en la glicosilación ligada a N se han asociado con diferentes enfermedades, incluida la artritis reumatoide , [12] diabetes tipo 1 , [13] enfermedad de Crohn , [14] y cánceres. [15] [16]
Las mutaciones en dieciocho genes implicados en la glicosilación ligada a N dan lugar a una variedad de enfermedades, la mayoría de las cuales afectan al sistema nervioso . [3] [16]
Muchas proteínas terapéuticas del mercado son anticuerpos , que son glicoproteínas ligadas a N. Por ejemplo, Etanercept , Infliximab y Rituximab son proteínas terapéuticas N -glicosiladas.
La importancia de la glicosilación ligada a N es cada vez más evidente en el campo de los productos farmacéuticos . [17] Aunque los sistemas de producción de proteínas bacterianas o de levadura tienen importantes ventajas potenciales, como alto rendimiento y bajo costo, surgen problemas cuando la proteína de interés es una glicoproteína. La mayoría de los sistemas de expresión procarióticos como E. coli no pueden realizar modificaciones postraduccionales . Por otro lado, los huéspedes de expresión eucariotas, como las levaduras y las células animales, tienen diferentes patrones de glicosilación. Las proteínas producidas en estos huéspedes de expresión a menudo no son idénticas a las proteínas humanas y, por tanto, provocan reacciones inmunogénicas en los pacientes. Por ejemplo, S. cerevisiae (levadura) a menudo produce glicanos con alto contenido de manosa que son inmunogénicos.
Los sistemas de expresión de mamíferos no humanos, como las células CHO o NS0, tienen la maquinaria necesaria para agregar glicanos complejos de tipo humano. Sin embargo, los glicanos producidos en estos sistemas pueden diferir de los glicanos producidos en humanos, ya que pueden estar protegidos tanto con ácido N -glicolilneuramínico (Neu5Gc) como con ácido N -acetilneuramínico (Neu5Ac), mientras que las células humanas solo producen glicoproteínas que contienen ácido N -acetilneuramínico. Además, las células animales también pueden producir glicoproteínas que contienen el epítopo galactosa-alfa-1,3-galactosa , que puede inducir reacciones alergénicas graves, incluido shock anafiláctico , en personas que tienen alergia al alfa-gal .
Estos inconvenientes se han abordado mediante varios enfoques, como la eliminación de las vías que producen estas estructuras de glucanos mediante inactivaciones genéticas. Además, se han modificado genéticamente otros sistemas de expresión para producir glicoproteínas terapéuticas con glicanos unidos a N similares a los humanos . Estos incluyen levaduras como Pichia pastoris , [18] líneas celulares de insectos, plantas verdes, [19] e incluso bacterias.