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Fenilalanina amoniaco liasa

La enzima fenilalanina amoniaco liasa (EC 4.3.1.24) cataliza la conversión de L - fenilalanina en amoniaco y ácido trans -cinámico .: [1]

L -fenilalanina = trans -cinamato + NH3

La fenilalanina amonia liasa (PAL) es el primer y comprometido paso en la vía del fenilpropanoide y, por lo tanto, está involucrada en la biosíntesis de los compuestos polifenólicos como flavonoides , fenilpropanoides y lignina en plantas . [2] [3] La fenilalanina amonia liasa se encuentra ampliamente en plantas, así como en algunas bacterias , levaduras y hongos , con isoenzimas existentes dentro de muchas especies diferentes. Tiene una masa molecular en el rango de 270-330  kDa . [1] [4] La actividad de PAL se induce dramáticamente en respuesta a varios estímulos como heridas en los tejidos, ataque patógeno , luz, bajas temperaturas y hormonas . [1] [5] La PAL se ha estudiado recientemente por sus posibles beneficios terapéuticos en humanos afectados por fenilcetonuria . [6] También se ha utilizado en la generación de L -fenilalanina como precursor del edulcorante aspartamo . [7]

La enzima es un miembro de la familia de las amoniaco -liasas , que escinden enlaces carbono-nitrógeno. Al igual que otras liasas, la PAL requiere solo un sustrato para la reacción directa, pero dos para la inversa. Se cree que es mecanísticamente similar a la enzima relacionada histidina amoniaco-liasa (EC:4.3.1.3, HAL). [8] El nombre sistemático de esta clase de enzimas es L -fenilalanina amoniaco-liasa ( formadora de trans -cinamato) . Anteriormente, se designaba como EC 4.3.1.5, pero esa clase ha sido rediseñada como EC 4.3.1.24 (fenilalanina amoniaco-liasas), EC 4.3.1.25 (tirosina amoniaco-liasas) y EC 4.3.1.26 (fenilalanina/tirosina amoniaco-liasas). Otros nombres de uso común incluyen tirasa , fenilalanina desaminasa , tirosina amoniaco-liasa , L -tirosina amoniaco-liasa , fenilalanina amonio-liasa , PAL y L -fenilalanina amoniaco-liasa .

Mecanismo

La fenilalanina amoniaco liasa es específica para la L -fenilalanina y, en menor medida, para la L - tirosina . [9] [10] La reacción catalizada por PAL es una reacción de eliminación espontánea en lugar de una desaminación oxidativa . [11]

El cofactor 3,5-dihidro-5-metildieno-4H-imidazol-4-ona (MIO) está involucrado en la reacción y se encuentra sobre el polo positivo de tres hélices polares en el sitio activo, lo que ayuda a aumentar su electrofilicidad . [12] MIO es atacado por el anillo aromático de L -phe, que activa el enlace CH en el carbono β para la desprotonación por un residuo básico . [13] [14] El intermedio carbanión de esta reacción de eliminación de E1cB , que está estabilizado por regiones positivas parciales en el sitio activo, luego expulsa amoníaco para formar el alqueno cinamato. Se cree que el mecanismo de la reacción de PAL es similar al mecanismo de la enzima relacionada histidina amoníaco liasa. [13]

Propuesta de formación autocatalítica del cofactor MIO a partir del tripéptido Ala-Ser-Gly mediante dos pasos de eliminación de agua. [15]

Durante mucho tiempo se pensó que un residuo de deshidroalanina era el residuo catalítico electrofílico clave en PAL y HAL, pero más tarde se descubrió que el residuo activo era MIO, que es incluso más electrofílico. [16] [17] Se forma por ciclización y deshidratación del segmento tripéptido Ala-Ser-Gly conservado. El primer paso de la formación de MIO es una ciclización-eliminación por un ataque nucleofílico intramolecular del nitrógeno de Gly204 en el grupo carbonilo de Ala202. Una posterior eliminación de agua de la cadena lateral de Ser203 completa el sistema de dobles enlaces conjugados cruzados. [15] Se dan números para la fenilalanina amoniaco liasa de Petroselinum crispum ( PDB 1W27). Aunque MIO es una modificación polipeptídica, se propuso llamarlo un grupo prostético, porque tiene la calidad de un compuesto orgánico agregado. [8]

La PAL es inhibida por el ácido transcinámico y, en algunas especies, puede ser inhibida por derivados del ácido transcinámico . [1] [18] Los aminoácidos no naturales D -Phe y D -Tyr, las formas enantioméricas del sustrato normal, son inhibidores competitivos . [9]

Estructura

Sitio activo de PAL

La fenilalanina amoniaco liasa se compone de cuatro subunidades idénticas compuestas principalmente de hélices alfa , con pares de monómeros que forman un único sitio activo . [17] La ​​catálisis en PAL puede estar gobernada por los momentos dipolares de siete hélices alfa diferentes asociadas con el sitio activo. [19] El sitio activo contiene el grupo electrofílico MIO unido de forma no covalente a tres hélices. Leu266, Asn270, Val269, Leu215, Lys486 e Ile472 se encuentran en las hélices del sitio activo, mientras que Phe413, Glu496 y Gln500 contribuyen a la estabilización del cofactor MIO. La orientación de los momentos dipolares generados por las hélices dentro del sitio activo genera una región electropositiva para una reactividad ideal con MIO. Las regiones parcialmente positivas en el sitio activo también pueden ayudar a estabilizar la carga de un intermedio de carbanión. La PAL es estructuralmente similar a la histidina amoniaco liasa, que está relacionada mecánicamente, aunque la PAL tiene aproximadamente 215 residuos adicionales. [17]

Función

La fenilalanina amoniaco liasa puede realizar diferentes funciones en diferentes especies. Se encuentra principalmente en algunas plantas y hongos (es decir, levaduras). En las células de hongos y levaduras, la PAL desempeña un papel catabólico importante , generando carbono y nitrógeno . [2] En las plantas es una enzima biosintética clave que cataliza el primer paso en la síntesis de una variedad de compuestos polifenílicos [2] [3] y está principalmente involucrada en los mecanismos de defensa. La PAL está involucrada en 5 vías metabólicas : metabolismo de la tirosina , metabolismo de la fenilalanina , metabolismo del nitrógeno , biosíntesis de fenilpropanoides y biosíntesis de alcaloides .

Relevancia de la enfermedad

Se está estudiando la terapia de sustitución enzimática con PAL para tratar la fenilcetonuria (PKU), un trastorno genético autosómico recesivo en humanos en el que las mutaciones en el gen de la fenilalanina hidroxilasa (PAH, EC 1.14.16.1) inactivan la enzima. [6] Esto conduce a una incapacidad del paciente para metabolizar la fenilalanina, lo que causa niveles elevados de Phe en el torrente sanguíneo ( hiperfenilalaninemia ) y retraso mental si la terapia no se inicia al nacer. [6]

En mayo de 2018, la FDA aprobó la pegvaliasa , una fenilalanina amoniaco-liasa pegilada recombinante para el tratamiento de la PKU que había sido desarrollada por Biomarin. [20] [21]

En las plantas

Vàsquez et al. 2017 investigaron Lactuca sativa y descubrieron que el tratamiento con UV-C aumentó la actividad de la enzima PAL. Este aumento da como resultado una menor susceptibilidad a Botrytis cinerea . [22]

Investigación

Edulcorantes artificiales

Se ha estudiado la reacción inversa catalizada por PAL para convertir el ácido trans -cinámico en L -fenilalanina, que es un precursor del edulcorante aspartamo. Este proceso fue desarrollado por Genex Corporation, pero nunca se adoptó comercialmente. [23]

Síntesis de aminoácidos no naturales

De manera análoga a cómo se sintetiza el aspartamo, la PAL también se utiliza para sintetizar aminoácidos no naturales a partir de varios ácidos cinámicos sustituidos con fines de investigación. [24] Sin embargo, el impedimento estérico de la sustitución de areno limita la utilidad de la PAL para este propósito. [25] Por ejemplo, cuando se utilizó Rhodotorula glutinis para efectuar esta biotransformación, se descubrió que la enzima era intolerante a todos los sustituyentes para distintos del flúor , presumiblemente debido al pequeño radio atómico del elemento . Se descubrió que las posiciones meta y orto eran más tolerantes, pero aún limitadas por sustituyentes más grandes. Por ejemplo, el sitio activo de la enzima permitía la sustitución orto metoxi pero prohibía la meta etoxi . Otros organismos con diferentes versiones de la enzima pueden estar menos limitados de esta manera. [26] [27]

Estudios estructurales

A finales de 2007, se han resuelto cinco estructuras para esta clase de enzimas, con códigos de acceso PDB 1T6J, 1T6P, 1W27, 1Y2M y 2NYF.

Referencias

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Lectura adicional