La citometría es la medición del número y las características de las células . Las variables que se pueden medir mediante métodos citométricos incluyen el tamaño celular , el recuento celular , la morfología celular (forma y estructura), la fase del ciclo celular , el contenido de ADN y la existencia o ausencia de proteínas específicas en la superficie celular o en el citoplasma . [1] La citometría se utiliza para caracterizar y contar células sanguíneas en análisis de sangre comunes, como el hemograma completo . De manera similar, la citometría también se utiliza en la investigación de biología celular y en diagnósticos médicos para caracterizar células en una amplia gama de aplicaciones asociadas con enfermedades como el cáncer y el SIDA . [ cita requerida ]
La citometría de imágenes es la forma más antigua de citometría. Los citómetros de imágenes funcionan mediante la obtención de imágenes estáticas de una gran cantidad de células mediante microscopía óptica . Antes del análisis, las células suelen teñirse para mejorar el contraste o para detectar moléculas específicas marcándolas con fluorocromos . Tradicionalmente, las células se observan dentro de un hemocitómetro para facilitar el recuento manual. [ cita requerida ]
Desde la introducción de la cámara digital , a mediados de la década de 1990, el nivel de automatización de los citómetros de imágenes ha aumentado de manera constante. Esto ha llevado a la disponibilidad comercial de citómetros de imágenes automatizados, que van desde simples contadores de células hasta sofisticados sistemas de detección de alto contenido .
Debido a las dificultades iniciales de la automatización de la microscopía, el citómetro de flujo ha sido desde mediados de la década de 1950 el dispositivo citométrico dominante. [2] Los citómetros de flujo funcionan alineando células individuales mediante técnicas de flujo. Las células se caracterizan ópticamente o mediante el uso de un método de impedancia eléctrica llamado principio de Coulter . Para detectar moléculas específicas cuando se caracterizan ópticamente, las células se tiñen en la mayoría de los casos con el mismo tipo de fluorocromos que se utilizan en los citómetros de imagen. Los citómetros de flujo generalmente brindan menos datos que los citómetros de imagen, pero tienen un rendimiento significativamente mayor. [ cita requerida ]
Los separadores de células son citómetros de flujo capaces de clasificar las células según sus características. La clasificación se logra mediante el uso de una tecnología similar a la que se utiliza en las impresoras de inyección de tinta . La corriente de fluido se divide en gotitas mediante una vibración mecánica. A continuación, las gotitas se cargan eléctricamente de acuerdo con las características de la célula contenida en la gotita. Dependiendo de su carga, las gotitas son finalmente desviadas por un campo eléctrico hacia diferentes contenedores. [ cita requerida ]
Una característica clave de los citómetros time-lapse es el uso de fuentes de luz que no generan calor, como diodos emisores de luz . Esto permite colocar un citómetro time-lapse dentro de una incubadora de cultivo celular convencional para facilitar la observación continua de los procesos celulares sin que se acumule calor dentro de la incubadora.
La historia temprana de la citometría está estrechamente relacionada con el desarrollo del conteo de células sanguíneas. Gracias al trabajo de Karl von Vierordt , Louis-Charles Malassez , Karl Bürker y otros, a fines del siglo XIX se pudo medir con precisión la concentración de células sanguíneas utilizando una cámara de conteo de células sanguíneas, el hemocitómetro y un microscopio óptico . [3] [4]
Hasta la década de 1950, el hemocitómetro era el método estándar para contar células sanguíneas. [5] En las aplicaciones de recuento de células sanguíneas, el hemocitómetro ha sido reemplazado por contadores de células electrónicos . Sin embargo, el hemocitómetro todavía se usa para contar células en laboratorios de cultivo celular. Sucesivamente, la tarea manual de recuento, utilizando un microscopio, es asumida por pequeños citómetros de imágenes automatizados. [ cita requerida ]
En 1904, Moritz von Rohr y August Köhler, de Carl Zeiss en Jena, construyeron el primer microscopio ultravioleta. El objetivo del microscopio era obtener una resolución óptica más alta utilizando iluminación con una longitud de onda más corta que la luz visible. Sin embargo, experimentaron dificultades con la autofluorescencia al observar material biológico. Afortunadamente, Köhler vio el potencial de la fluorescencia. Heinrich Lehmann desarrolló una técnica de filtrado para la luz de excitación de fluorescencia en Zeiss en 1910, basada en el trabajo de Robert Wood . Sin embargo, el "Lumineszenzmikroskop" que desarrolló fue el segundo en el mercado, después del desarrollado independientemente por Oskar Heimstädt, que trabajaba en C Reichert, Optische Werke AG en Viena, que hoy es parte de Leica Microsystems . [6] [7] [8]
A principios de la década de 1930, varias empresas fabricaron microscopios fluorescentes ultravioleta. El escenario estaba preparado para que la citometría fuera más allá del hemocitómetro, ahora establecido. En ese momento, Torbjörn Caspersson , que trabajaba en el Instituto Karolinska en Estocolmo, desarrolló una serie de instrumentos progresivamente más sofisticados llamados citofotómetros . Estos instrumentos combinaban un microscopio fluorescente con un espectrofotómetro para cuantificar los ácidos nucleicos celulares y su relación con el crecimiento y la función celular. El primer aparato de Caspersson ahora parece desesperanzadoramente primitivo. Pero, incluso este aparato primitivo dio resultados y atrajo la atención de otros investigadores. Muchos de los avances en citología analítica a partir de la década de 1940 fueron realizados por personas que hicieron la peregrinación a Estocolmo. [9]
Los primeros intentos de automatizar el recuento de células se realizaron alrededor de la Segunda Guerra Mundial. Gucker et al. construye un dispositivo para detectar bacterias en aerosoles. [10] Lagercrantz construye un contador de células automatizado basado en microscopía [11] e identifica las dificultades en la alineación de las células para ser contadas individualmente utilizando microscopía, como Moldavan había propuesto en 1934. [12] Joseph y Wallace Coulter sortean estas dificultades inventando el principio de usar impedancia eléctrica para contar y medir partículas microscópicas suspendidas en un fluido. [5] [13] Este principio se conoce hoy como el principio de Coulter y se utilizó en el contador de células sanguíneas automatizado lanzado por Coulter Electronics en 1954. El “ contador Coulter ” fue el primer citómetro de flujo comercial. [ cita requerida ]
Durante la década de 1960, Dittrich, Göhde y Kamentsky mejoraron el diseño iniciado por Caspersson 30 años antes. El citofotómetro de pulso de Dittrich y Göhde se construyó alrededor de un microscopio fluorescente Zeiss y Partec GmbH lo comercializó como ICP 11 en 1968. El dispositivo de Kamentsky fue comercializado por Bio/Physics Systems Inc. como Cytograph en 1970. [14] [15] Estos dispositivos podían contar células, como el contador Coulter anterior. Pero lo más importante es que también podían medir características celulares. Sin embargo, estos primeros citofotómetros se basaban en la microscopía. [16]
En 1953, Crosland-Taylor publicó un intento fallido de contar glóbulos rojos mediante microscopía, en el que resolvió el problema de la alineación de las células utilizando líquido de envoltura para enfocar hidrodinámicamente las células. [2] A finales de los años 1960, Van Dilla, del Laboratorio Nacional de Los Álamos, construyó el primer citofotómetro no basado en microscopía. Lo hizo combinando el avance de Crosland-Taylor con los tintes fluorescentes desarrollados originalmente para microscopía y un sistema de detección fluorescente basado en láser: el citómetro de flujo tal como lo conocemos hoy. [17] [18] [19] Fulwyler, también en Los Álamos, combina el principio de Coulter con la tecnología de impresora de inyección de tinta continua para crear el primer clasificador de células en 1965. [20]
En 1973, Steinkamp y el equipo de Los Álamos continuaron con un clasificador de células basado en fluorescencia. [21]
En 1978, en la Conferencia de la Fundación Americana de Ingeniería en Pensacola, Florida, el nombre de citofotometría de pulso se cambió a citometría de flujo , un término que rápidamente se hizo popular. [22] En ese momento, la citofotometría de pulso había evolucionado hasta convertirse en la forma moderna de citometría de flujo, iniciada por Van Dilla diez años antes. [ cita requerida ]
