Una suspensión celular o cultivo en suspensión es un tipo de cultivo celular en el que se permite que células individuales o pequeños agregados de células funcionen y se multipliquen en un medio de crecimiento agitado , formando así una suspensión . El cultivo en suspensión es uno de los dos tipos clásicos de cultivo celular, el otro es el cultivo adherente . La historia del cultivo celular en suspensión se alinea estrechamente con la historia del cultivo celular en general, pero difiere en los métodos de mantenimiento y las aplicaciones comerciales. Las células en sí pueden derivarse de tejido homogeneizado o de soluciones celulares heterogéneas. El cultivo celular en suspensión se usa comúnmente para cultivar líneas celulares no adhesivas como células hematopoyéticas , células vegetales y células de insectos . [1] Si bien algunas líneas celulares se cultivan en suspensión, la mayoría de las líneas celulares de mamíferos disponibles comercialmente son adherentes. [2] [3] Los cultivos celulares en suspensión deben agitarse para mantener las células en suspensión y pueden requerir equipo especializado (por ejemplo, placa de agitación magnética, agitadores orbitales, incubadoras) y matraces (por ejemplo, matraces de cultivo, matraces giratorios, matraces agitadores). [4] Estos cultivos deben mantenerse con medios que contengan nutrientes y cultivarse en un rango de densidad celular específico para evitar la muerte celular. [5]
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La historia del cultivo de células en suspensión está estrechamente ligada a la historia general del cultivo de células y tejidos. En 1885, Wilhelm Roux sentó las bases para el futuro cultivo de tejidos, al desarrollar un tampón salino que se utilizó para mantener vivas las células (embriones de pollo) durante unos días. [6] Ross Granville Harrison, en 1907, desarrolló técnicas de cultivo celular in vitro , incluida la modificación de la técnica de gota colgante para células nerviosas y la introducción de una técnica aséptica en el proceso de cultivo. [7] Más tarde, en 1910, Montrose Thomas Burrows adaptó la técnica de Harrison y colaboró con Alexis Carrel para establecer múltiples cultivos de tejidos que pudieran mantenerse in vitro utilizando plasma fresco combinado con soluciones salinas. [8] Carrel continuó desarrollando la primera línea celular conocida, una línea derivada del corazón de embrión de pollo que se mantuvo de forma continua durante 34 años. [9] Aunque la "inmortalidad" de la línea celular fue cuestionada más tarde por Leonard Hayflick , este fue un gran avance e inspiró a otros a seguir creando otras líneas celulares. [10] Cabe destacar que en 1952, George Otto Gay y su asistente Mary Kubicek cultivaron la primera línea celular inmortalizada derivada de humanos: HeLa . Mientras que las otras líneas celulares eran adherentes, las células HeLa pudieron mantenerse en suspensión. [11]
Todas las células primarias (células derivadas directamente de un sujeto) deben primero extraerse de un sujeto, aislarse (usando enzimas de digestión) y suspenderse en un medio antes de ser cultivadas. [1] Sin embargo, esto no significa que estas células sean compatibles con el cultivo en suspensión, ya que la mayoría de las células de mamíferos son adherentes y necesitan unirse a una superficie para dividirse. Los glóbulos blancos pueden extraerse de un sujeto y cultivarse en suspensión, ya que existen naturalmente en suspensión en la sangre. [12] La adhesión de glóbulos blancos in vivo es típicamente el resultado de una respuesta inmunitaria inflamatoria y requiere interacciones específicas entre células que no deberían ocurrir en una suspensión de un solo tipo de glóbulo blanco. [13]
Las líneas celulares inmortalizadas de mamíferos (células que pueden replicarse indefinidamente), células vegetales y células de insectos se pueden obtener criopreservadas de los fabricantes y se pueden usar para iniciar un cultivo en suspensión. [14] Para iniciar un cultivo a partir de células criopreservadas, primero se deben descongelar las células y agregarlas a un matraz o biorreactor que contenga medios. Dependiendo del agente crioprotector, es posible que sea necesario lavar las células para evitar efectos nocivos del agente. [3]
Los cultivos celulares en suspensión son similares a los cultivos adherentes en varios aspectos. Ambos requieren medios especializados que contengan nutrientes, recipientes que permitan la transferencia de gases, condiciones asépticas para evitar la contaminación y pases frecuentes para evitar el hacinamiento de células. Sin embargo, incluso dentro de estas similitudes, existen algunas diferencias clave entre estos métodos de cultivo. Por ejemplo, aunque tanto los cultivos celulares adherentes como los de suspensión se pueden mantener en matraces estándar como el matraz de cultivo de tejidos T-75, los cultivos en suspensión deben agitarse para evitar que se depositen en el fondo del matraz. Mientras que los cultivos celulares adherentes se pueden mantener en matraces planos con una gran superficie (para promover la adhesión celular), los cultivos en suspensión requieren agitación; de lo contrario, las células caerán al fondo de un matraz, lo que afectará en gran medida su acceso a los nutrientes y al oxígeno, lo que eventualmente provocará la muerte celular. [4] Por esta razón, se han desarrollado matraces especializados (incluidos el matraz agitador y el matraz agitador, que se analizan a continuación) para agitar los medios y mantener las células en suspensión. Sin embargo, la agitación de los medios somete a las células a fuerzas de cizallamiento que pueden estresarlas y afectar negativamente al crecimiento. Aunque tanto los cultivos celulares adherentes como los cultivos en suspensión requieren medios, los medios utilizados en los cultivos en suspensión pueden contener un surfactante para proteger a las células de las fuerzas de cizallamiento además de los aminoácidos, las vitaminas y la solución salina que contienen los medios de cultivo como el DMEM . [5]
Los matraces agitadores, que se utilizan para cultivos en suspensión, contienen una barra agitadora magnética que hace circular el medio por todo el matraz y mantiene las células en suspensión. [15] Los matraces agitadores contienen una abertura central tapada flanqueada por dos brazos salientes que también están tapados y permiten un intercambio de gases adicional. La barra agitadora magnética en sí suele estar suspendida de una varilla unida a la tapa central para maximizar la circulación del medio en la suspensión celular. Al cultivar células, el matraz agitador que contiene las células se coloca en una placa de agitación magnética, dentro de una incubadora y los parámetros del agitador deben ajustarse con cuidado para evitar matar las células con fuerzas de corte. [16]
Los matraces agitadores también se utilizan para cultivos en suspensión y parecen similares a los matraces Erlenmeyer típicos, pero tienen una tapa semipermeable para permitir el intercambio de gases. [17] Durante el cultivo de células en suspensión, los matraces agitadores se cargan con células y el medio apropiado antes de colocarlos en un agitador orbital. Para optimizar la proliferación del cultivo celular, las revoluciones por minuto del agitador orbital deben ajustarse dentro de un rango aceptable dependiendo de las células y el medio utilizado. Se debe permitir que el medio se agite, pero no puede perturbar demasiado a las células causándoles un estrés excesivo. Los matraces agitadores se utilizan a menudo para cultivos de fermentación con microorganismos como la levadura. [18]
El paso o subcultivo de cultivos de células en suspensión es más sencillo que el paso de células adherentes. Mientras que las células adherentes requieren un procesamiento inicial con una enzima de digestión, para eliminarlas de la superficie del matraz de cultivo, las células en suspensión flotan libremente en el medio. [19] Luego, se puede tomar una muestra del cultivo y analizarla para determinar la proporción de células vivas y muertas (usando un colorante como el azul tripán ) y la concentración total de células en el matraz (usando un hemocitómetro ). Usando esta información, una parte del cultivo en suspensión actual se transferirá a un matraz nuevo y se complementará con medio. El número de paso debe registrarse, particularmente si las células son primarias y no inmortalizadas, ya que las líneas celulares primarias eventualmente sufrirán senescencia . [20] Las células en suspensión a menudo se pasan directamente sin cambiar el medio. Para cambiar el medio para un cultivo en suspensión, todas las células del recipiente actual deben retirarse y centrifugarse en un pellet. Luego, el exceso de medio se retira de la muestra centrifugada y el matraz se vuelve a llenar con medio nuevo antes de volver a agregar las células al matraz. Los cambios de medio y el subcultivo son importantes para mantener las líneas celulares, ya que las células consumen nutrientes del medio para expandirse. Las células también crecen exponencialmente hasta que el entorno se vuelve inhóspito debido a la falta de nutrientes, un pH extremo o la falta de espacio para crecer.
A diferencia de los cultivos adherentes , que están limitados por la superficie que se les proporciona para expandirse, los cultivos en suspensión están limitados por el volumen de su recipiente. Es decir, las células en suspensión pueden existir en cantidades mucho mayores en un matraz determinado y son las preferidas cuando se utilizan células para elaborar productos que incluyen proteínas, anticuerpos, metabolitos o simplemente para producir un gran volumen de células. Sin embargo, hay muchas menos líneas de células en suspensión de mamíferos que líneas de células adhesivas de mamíferos. La mayoría de los cultivos en suspensión a gran escala involucran células no mamíferas y se llevan a cabo en biorreactores.
Algunos ejemplos de cultivo de células en suspensión:
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