Las cianinas, también denominadas tetrametilindo(di)-carbocianinas [1], son una familia de colorantes sintéticos que pertenece al grupo de las polimetinas . Aunque el nombre deriva etimológicamente de términos para tonos de azul , la familia de las cianinas cubre el espectro electromagnético desde el IR cercano hasta el UV .
Químicamente, las cianinas son un sistema conjugado entre dos átomos de nitrógeno ; en cada estructura de resonancia , exactamente un átomo de nitrógeno se oxida a iminio . Normalmente, forman parte de un sistema heterocíclico nitrogenado . [2]
La principal aplicación de los colorantes de cianina es el etiquetado biológico . Sin embargo, existe una amplia literatura tanto sobre su síntesis como sobre sus usos, y las cianinas son comunes en algunos soportes CD y DVD .
Las cianinas se han clasificado de muchas maneras: [3]
Además, se reconocen estas clases: [4]
donde dos nitrógenos cuaternarios están unidos por una cadena de polimetina . [5] Ambos nitrógenos pueden ser cada uno independientemente parte de un resto heteroaromático , como pirrol , imidazol , tiazol , piridina , quinolina , indol , benzotiazol , etc.
Las cianinas se sintetizaron por primera vez hace más de un siglo. Se utilizaron originalmente, y todavía se utilizan, para aumentar el rango de sensibilidad de las emulsiones fotográficas , es decir, para aumentar el rango de longitudes de onda que formarán una imagen en la película, haciendo que la película sea pancromática . [4] Las cianinas también se utilizan en soportes CD-R y DVD-R . Los que se utilizan son en su mayoría de color verde o azul claro y son químicamente inestables. Por ese motivo, los discos de cianina no estabilizados no son adecuados para su uso en CD y DVD de archivo. Los discos de cianina recientes contienen estabilizadores, típicamente un átomo de metal unido a la molécula de cianina, [6] que retardan significativamente el deterioro. Estos discos suelen tener una vida útil de 75 años o más. Los otros colorantes utilizados en los CD-R son la ftalocianina y el azo .
Para aplicaciones en biotecnología, se sintetizan tintes de cianina especiales a partir de estructuras de 2, 3, 5 o 7-metino con grupos reactivos en uno o ambos extremos del nitrógeno para que puedan unirse químicamente a ácidos nucleicos o moléculas de proteínas . El etiquetado se realiza con fines de visualización y cuantificación. Las aplicaciones biológicas incluyen hibridación genómica comparativa y chips de genes , que se utilizan en transcriptómica , y diversos estudios en proteómica como la localización de ARN, [7] estudios de interacción molecular mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia ( FRET ) e inmunoensayos de fluorescencia .
Los tintes de cianina están disponibles con diferentes modificaciones, como sustituyentes metilo, etilo o butilo, grupos carboxilo, acetilmetoxi y sulfo, que alteran su hidrofilicidad. [8]
Ex (nm): Longitud de onda de excitación en nanómetros
Em (nm): Longitud de onda de emisión en nanómetros
MW: Peso molecular
QY: Rendimiento cuántico
* Depende en gran medida de la viscosidad, la temperatura y las interacciones biomoleculares. [11]
Debido a que producen una fluorescencia más brillante y estable, las cianinas pueden reemplazar ventajosamente los tintes convencionales como la fluoresceína y las rodaminas .
Cy3 tiene fluorescencia de color amarillo verdoso (excitación de ~550 nm , emisión de ~570 nm), mientras que Cy5 es fluorescente en la región del rojo lejano (excitación de ~650 nm, emisión de 670 nm). [12] Cy3 puede detectarse mediante varios fluorómetros, generadores de imágenes y microscopios con filtros estándar para tetrametilrodamina (TRITC). Debido a su alto coeficiente de extinción molar , este colorante también se detecta fácilmente a simple vista en geles de electroforesis y en solución. Cy5 se convirtió en un sustituto popular de los tintes fluorescentes de color rojo lejano debido a su alto coeficiente de extinción (se puede detectar tan solo 1 nanomol en electroforesis en gel a simple vista) y su máxima emisión de fluoróforos en la región roja, donde muchos detectores CCD tienen máxima sensibilidad y Los objetos biológicos producen una baja interferencia de fondo.
Los escáneres [ ¿cuáles? ] en realidad utilizan diversas longitudes de onda de emisión láser (normalmente 532 nm y 635 nm ) y longitudes de onda de filtro (550-600 nm y 655-695 nm ) para evitar la contaminación de fondo. Por lo tanto, pueden distinguir fácilmente los colores de Cy3 y Cy5, y también pueden cuantificar la cantidad de etiquetado de Cy3 y Cy5 en una muestra (detección multiparamétrica). [ cita necesaria ]
Cy3.5 puede reemplazar la sulforodamina 101.
Cy5.5 es un tinte emisor de fluorescencia en el infrarrojo cercano (IR) (excitación/emisión máxima 678/694 nm).
Cy7 es un fluor de infrarrojo cercano que es invisible a simple vista (excitación/emisión máxima 750/776 nm). Se utiliza en aplicaciones de imágenes in vivo , así como en el tinte Cy7.5.
Los tintes sulfo -cianina tienen uno o dos grupos sulfo, lo que hace que el tinte Cy sea soluble en agua, pero hay formas tri y cuadrisulfonadas disponibles para una solubilidad en agua aún mayor. [8] La PEGilación es otra modificación que confiere hidrofilia, no sólo al tinte sino también al conjugado marcado.
La nomenclatura Cy3 y Cy5 fue propuesta por primera vez por Ernst et al. [5] en 1989, y no es estándar ya que no da ninguna pista de sus estructuras químicas. En el artículo original, el número designaba el recuento de metinos (como se muestra) y las cadenas laterales no estaban especificadas. Debido a esta ambigüedad, varias estructuras se denominan Cy3 y Cy5 en la literatura. Los grupos R no tienen por qué ser idénticos. En los colorantes utilizados son cadenas alifáticas cortas , una o ambas de las cuales terminan en un resto altamente reactivo como N-hidroxisuccinimida o maleimida .
Se desarrollaron muchos análogos de los tintes estándar Cy 2/3/3.5/5/5.5/7/7.5, utilizando diversas modificaciones: tintes Alexa Fluor , Dylight , tintes FluoProbes , tintes Sulfo Cy, [13] tintes Seta, [14] tintes IRIS. de Cyanine Technologies [15] y otros se pueden usar indistintamente con tintes Cy en la mayoría de las aplicaciones bioquímicas, con mejoras afirmadas en solubilidad, fluorescencia o fotoestabilidad. [16] [17]
Si bien la protección de patente para la serie estándar de tintes Cy ha caducado, la marca registrada Cy permanece vigente. En consecuencia, ahora se venden tintes que son idénticos a los tintes Cy, pero con nombres diferentes.
Los colorantes de cianina se utilizan para marcar proteínas, anticuerpos, péptidos, sondas de ácido nucleico y cualquier otro tipo de biomoléculas que se utilizarán en una variedad de técnicas de detección de fluorescencia: citometría de flujo , microscopía (principalmente rango visible, pero también UV , IR ), microplacas. ensayos, microarrays , así como "sondas luminosas" e imágenes in vivo. [18]
En experimentos de microarrays , el ADN o el ARN se marcan con Cy3 o Cy5 que se ha sintetizado para transportar un grupo reactivo éster N-hidroxisuccinimidílico (éster NHS ). Dado que los ésteres de NHS reaccionan fácilmente sólo con grupos amina alifáticos , de los que carecen los ácidos nucleicos, los nucleótidos deben modificarse con grupos aminoalilo . Esto se hace mediante la incorporación de nucleótidos modificados con aminoalilo durante las reacciones de síntesis. Una buena proporción es una etiqueta cada 60 bases, de manera que las etiquetas no estén demasiado cerca unas de otras, lo que daría como resultado efectos de extinción .
Para el etiquetado de proteínas, los colorantes Cy3 y Cy5 a veces llevan un grupo succinimidilo para reaccionar con aminas, o un grupo maleimida para reaccionar con un grupo sulfhidrilo de residuos de cisteína .
Cy5 es sensible a su entorno electrónico. Los cambios en la conformación de la proteína a la que está unida producirán una mejora o una extinción de la emisión. La tasa de este cambio se puede medir para determinar los parámetros cinéticos de la enzima. Los tintes se pueden utilizar para fines similares en experimentos FRET .
Cy3 y Cy5 se utilizan en experimentos de proteómica para que las muestras de dos fuentes se puedan mezclar y procesar juntas durante el proceso de separación. [19] [20] Esto elimina las variaciones debidas a diferentes condiciones experimentales que son inevitables si las muestras se procesaron por separado. Estas variaciones hacen que sea extremadamente difícil, si no imposible, utilizar computadoras para automatizar la adquisición de datos una vez completada la separación. El uso de estos tintes hace que la automatización sea trivial.
La palabra cianina proviene de la palabra inglesa "cyan", que convencionalmente significa un tono azul verdoso (cercano a "aqua") y se deriva del griego κυάνεος / κυανοῦς kyaneos/kyanous que significa un color algo diferente: "azul oscuro". ".
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