Una transposasa es una clase de enzimas capaces de unirse al extremo de un transposón y catalizar su movimiento a otra parte de un genoma , típicamente mediante un mecanismo de cortar y pegar o un mecanismo replicativo, en un proceso conocido como transposición. La palabra "transposasa" fue acuñada por primera vez por las personas que clonaron la enzima requerida para la transposición del transposón Tn3 . [1] La existencia de transposones fue postulada a fines de la década de 1940 por Barbara McClintock , quien estaba estudiando la herencia del maíz , pero la base molecular real para la transposición fue descrita por grupos posteriores. McClintock descubrió que algunos segmentos de cromosomas cambiaban su posición, saltando entre diferentes loci o de un cromosoma a otro. El reposicionamiento de estos transposones (que codificaban el color) permitió que se expresaran otros genes para el pigmento. [2] La transposición en el maíz causa cambios en el color; sin embargo, en otros organismos, como las bacterias, puede causar resistencia a los antibióticos . [2] La transposición también es importante para crear diversidad genética dentro de las especies y generar adaptabilidad a las condiciones de vida cambiantes. [3]
Las transposasas se clasifican con el número EC 2.7.7. Los genes que codifican transposasas están muy extendidos en los genomas de la mayoría de los organismos y son los genes más abundantes que se conocen. [4] Durante el curso de la evolución humana, hasta un 40% del genoma humano se ha movido mediante métodos como la transposición de transposones. [2]
La transposasa (Tnp) Tn5 es un miembro de la superfamilia de proteínas ARNasas que incluye integrasas retrovirales . La Tn5 se puede encontrar en las bacterias Shewanella y Escherichia . [5] El transposón codifica la resistencia a los antibióticos kanamicina y otros antibióticos aminoglucósidos. [3] [6]
La Tn5 y otras transposasas son notablemente inactivas. Debido a que los eventos de transposición de ADN son inherentemente mutagénicos, la baja actividad de las transposasas es necesaria para reducir el riesgo de causar una mutación fatal en el huésped y, por lo tanto, eliminar el elemento transponible . Una de las razones por las que la Tn5 es tan poco reactiva es porque los extremos N y C están ubicados relativamente cerca uno del otro y tienden a inhibirse entre sí. Esto se dilucidó mediante la caracterización de varias mutaciones que dieron como resultado formas hiperactivas de transposasas. Una de esas mutaciones, L372P, es una mutación del aminoácido 372 en la transposasa Tn5. Este aminoácido es generalmente un residuo de leucina en el medio de una hélice alfa. Cuando esta leucina se reemplaza con un residuo de prolina, la hélice alfa se rompe, lo que introduce un cambio conformacional en el dominio C-terminal, separándolo del dominio N-terminal lo suficiente como para promover una mayor actividad de la proteína. [3] La transposición de un transposón a menudo necesita sólo tres piezas: el transposón, la enzima transposasa y el ADN objetivo para la inserción del transposón. [3] Este es el caso de Tn5, que utiliza un mecanismo de cortar y pegar para mover los transposones. [3]
La Tn5 y la mayoría de las demás transposasas contienen un motivo DDE, que es el sitio activo que cataliza el movimiento del transposón. El aspartato-97, el aspartato-188 y el glutamato-326 forman el sitio activo, que es una tríada de residuos ácidos. [7] Se dice que el motivo DDE coordina iones metálicos divalentes, con mayor frecuencia magnesio y manganeso, que son importantes en la reacción catalítica. [7] Debido a que la transposasa es increíblemente inactiva, la región DDE se muta de modo que la transposasa se vuelve hiperactiva y cataliza el movimiento del transposón. [7] El glutamato se transforma en un aspartato y los dos aspartatos en glutamatos. [7] A través de esta mutación, el estudio de la Tn5 se hace posible, pero como resultado se pierden algunos pasos en el proceso catalítico. [3]
Existen varios pasos que catalizan el movimiento del transposón, entre ellos la unión de Tnp, la sinapsis (la creación de un complejo sináptico), la escisión, la captura del objetivo y la transferencia de la cadena. A continuación, la transposasa se une a la cadena de ADN y crea una pinza sobre el extremo del transposón del ADN y se inserta en el sitio activo. Una vez que la transposasa se une al transposón, produce un complejo sináptico en el que dos transposasas están unidas en una relación cis/trans con el transposón. [3]
En la escisión, los iones de magnesio activan el oxígeno de las moléculas de agua y las exponen al ataque nucleofílico. [6] Esto permite que las moléculas de agua corten las hebras 3' en ambos extremos y creen una formación de horquilla, que separa el transposón del ADN donante. [3] A continuación, la transposasa mueve el transposón a una ubicación adecuada. No se sabe mucho sobre la captura del objetivo, aunque existe un sesgo de secuencia que aún no se ha determinado. [3] Después de la captura del objetivo, la transposasa ataca el ADN objetivo a nueve pares de bases de distancia, lo que resulta en la integración del transposón en el ADN objetivo. [3]
Como se mencionó anteriormente, debido a las mutaciones del DDE, se pierden algunos pasos del proceso; por ejemplo, cuando este experimento se realiza in vitro y el tratamiento térmico con SDS desnaturaliza la transposasa. Sin embargo, aún no se sabe con certeza qué sucede con la transposasa in vivo . [3]
El estudio de la transposasa Tn5 es de importancia general debido a sus similitudes con el VIH -1 y otras enfermedades retrovirales. Al estudiar la Tn5, también se puede descubrir mucho sobre otras transposasas y sus actividades. [3]
En 2010, se utilizó Tn5 en la secuenciación del genoma mediante el uso de Tn5 para agregar adaptadores de secuenciación y fragmentar el ADN en una única reacción enzimática, [8] lo que redujo el tiempo y los requisitos de entrada en comparación con la preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación tradicional . La estrategia basada en Tn5 puede simplificar significativamente el protocolo de preparación de la biblioteca e incluso se puede incorporar en la PCR de colonias directa para grandes cantidades de aislamientos bacterianos sin un sesgo de cobertura obvio. [8] Las principales desventajas son un menor control del tamaño fragmentado en comparación con la fragmentación enzimática y la fragmentación mecánica, y un sesgo hacia un alto contenido de GC. [8] Este medio de preparación de la biblioteca también se utiliza en la técnica ATAC-seq .
La transposasa Sleeping Beauty (SB) es la recombinasa que impulsa el sistema de transposones Sleeping Beauty . [9] La transposasa SB pertenece a la familia DD[E/D] de transposasas, que a su vez pertenecen a una gran superfamilia de polinucleotidil transferasas que incluye la ARNasa H, la resolvasa RuvC Holliday, las proteínas RAG y las integrasas retrovirales. [10] [11] El sistema SB se utiliza principalmente en animales vertebrados para la transferencia de genes, [12] incluida la terapia génica, [13] [14] y el descubrimiento de genes. [15] [16] La SB100X diseñada es una enzima que dirige los altos niveles de integración de transposones. [17] [18]
El transposón Tn7 es un elemento genético móvil que se encuentra en muchos procariotas como Escherichia coli ( E. coli ), y fue descubierto por primera vez como una secuencia de ADN en cromosomas bacterianos y plásmidos naturales que codificaban resistencia a los antibióticos trimetoprima y estreptomicina . [19] [20] Específicamente clasificado como un elemento transponible (transposón), la secuencia puede duplicarse y moverse dentro de un genoma utilizando una enzima recombinasa autocodificada llamada transposasa, lo que resulta en efectos como crear o revertir mutaciones y cambiar el tamaño del genoma. El transposón Tn7 ha desarrollado dos mecanismos para promover su propagación entre procariotas. [21] Al igual que muchos otros transposones bacterianos, Tn7 se transpone a baja frecuencia y se inserta en muchos sitios diferentes con poca o ninguna selectividad de sitio. A través de esta primera vía, Tn7 se dirige preferentemente a plásmidos conjugables , que pueden replicarse y distribuirse entre bacterias. Sin embargo, Tn7 es único en el sentido de que también se transpone con alta frecuencia en un único sitio específico en los cromosomas bacterianos llamado attTn7. [22] Esta secuencia específica es un gen esencial y altamente conservado que se encuentra en muchas cepas de bacterias. Sin embargo, la recombinación no es perjudicial para la bacteria huésped, ya que Tn7 en realidad se transpone aguas abajo del gen después de reconocerlo, lo que resulta en una forma segura de propagar el transposón sin matar al huésped. Esta vía de selección del sitio objetivo altamente evolucionada y sofisticada sugiere que esta vía evolucionó para promover la coexistencia entre el transposón y su huésped, así como la transmisión exitosa de Tn7 a futuras generaciones de bacterias. [21]
El transposón Tn7 tiene una longitud de 14 kb y codifica cinco enzimas. [21] Los extremos de la secuencia de ADN constan de dos segmentos con los que interactúa la transposasa Tn7 durante la recombinación. El segmento izquierdo (Tn7-L) tiene una longitud de 150 pb y la secuencia derecha (Tn7-R) tiene una longitud de 90 pb. Ambos extremos del transposón contienen una serie de sitios de unión de 22 pb que la transposasa Tn7 reconoce y a los que se une. Dentro del transposón hay cinco genes discretos que codifican proteínas que forman la maquinaria de transposición. Además, el transposón contiene un integrón , un segmento de ADN que contiene varios casetes de genes que codifican la resistencia a los antibióticos. [21]
El transposón Tn7 codifica cinco proteínas: TnsA, TnsB, TnsC, TnsD y TnsE. [21] TnsA y TnsB interactúan entre sí para formar la enzima transposasa Tn7, TnsAB. La enzima reconoce y se une específicamente a los extremos de la secuencia de ADN del transposón, y lo escinde introduciendo roturas de ADN de doble cadena en cada extremo. La secuencia escindida se inserta luego en otro sitio de ADN diana. Al igual que otros transposones caracterizados, el mecanismo de transposición de Tn7 implica la escisión de los extremos 3' del ADN donante por la proteína TnsA de la transposasa TnsAB. Sin embargo, Tn7 también se escinde de forma única cerca de los extremos 5', aproximadamente 5 pb desde el extremo 5' hacia el transposón Tn7, por la proteína TnsB de TnsAB. Después de la inserción del transposón en el sitio de ADN diana, los extremos 3' se unen covalentemente al ADN diana, pero los huecos de 5 pb siguen presentes en los extremos 5'. Como resultado, la reparación de estos huecos conduce a una duplicación adicional de 5 pb en el sitio diana. La proteína TnsC interactúa con la enzima transposasa y el ADN diana para promover los procesos de escisión e inserción. La capacidad de TnsC para activar la transposasa depende de su interacción con un ADN diana junto con su proteína diana apropiada, TnsD o TnsE. Las proteínas TnsD y TnsE son selectores de dianas alternativos que también son activadores de la unión al ADN que promueven la escisión e inserción de Tn7. Su capacidad para interactuar con un ADN diana particular es clave para la selección del sitio diana de Tn7. Las proteínas TnsA, TnsB y TnsC forman así la maquinaria central de Tn7: TnsA y TnsB interactúan entre sí para formar la transposasa, mientras que TnsC funciona como regulador de la actividad de la transposasa, comunicándose entre la transposasa y TnsD y TnsE. Cuando la proteína TnsE interactúa con la maquinaria central TnsABC, Tn7 dirige preferentemente las inserciones en plásmidos conjugables. Cuando la proteína TnsD interactúa con TnsABC, Tn7 dirige preferentemente las inserciones corriente abajo en un único sitio esencial y altamente conservado en el cromosoma bacteriano. Este sitio, attTn7, es reconocido específicamente por TnsD. [21]
