La toxina B de Clostridioides difficile ( TcdB ) es una citotoxina producida por la bacteria Clostridioides difficile . Es uno de los dos tipos principales de toxinas producidas por C. difficile , siendo la otra una enterotoxina relacionada ( Toxina A ). Ambas son muy potentes y letales. [2] [3]
La toxina B (TcdB) es una citotoxina que tiene un peso molecular de 270 kDa y un punto isoeléctrico , pl, de 4,1. [4] La toxina B tiene cuatro dominios estructurales diferentes: catalítico , cisteína proteasa , translocación y unión al receptor . [5] El dominio catalítico de la glucosiltransferasa N-terminal incluye los residuos de aminoácidos 1-544, mientras que el dominio de la cisteína proteasa incluye los residuos 545-801. Además, la región de translocación incorpora los residuos de aminoácidos del 802 al 1664, mientras que la región de unión al receptor es parte de la región C-terminal e incluye los residuos de aminoácidos del 1665 al 2366. [5]
La actividad de glicosilación de la toxina B ocurre en la región catalítica N-terminal (residuos 1-544). Esta región glicosila sustratos independientemente de cualquier actividad citotóxica. [6] Sin embargo, una pequeña deleción de la región de unión al receptor causa la atenuación de la actividad de la toxina B. [6] La región de translocación contiene una estructura similar a un tallo hidrofóbico, que puede ayudar a los residuos 958-1130 a formar poros que abarcan la membrana . [5] La región de unión al receptor que incluye la región repetitiva C-terminal (CRR) aumenta la interacción de la membrana de TcdB pero no participa en la formación de poros. [7] Además, la cisteína proteasa y las regiones de translocación tienen estructuras complejas que desempeñan un papel funcional importante en la translocación y la unión al receptor. [8] Sin embargo, la eliminación de la región de translocación de aminoácidos disminuye la actividad citotóxica 4 veces. Tanto las cisteína proteasas como la mayoría de las regiones de translocación albergan proteínas hidrófobas , que muestran acceso a TcdB y otras toxinas que cruzan las membranas celulares . [8]
El extremo C-terminal de TcdB (la región verde de la Fig. 2) contiene una región conocida como oligopéptidos repetitivos combinados (CROP) que contiene los residuos de aminoácidos 1831-2366. [9] Estos CROP están compuestos por 19-24 repeticiones cortas (SR) de aminoácidos, aproximadamente 31 repeticiones largas (LR) de aminoácidos, toxina A y toxina B. [9] [10] La región CROP de TcdB consta de 19 SR y 4 LR. Esta región de SR y LR permite la formación de motivos de unión a la pared celular que ayudan a unir las fracciones de azúcar de las superficies celulares. [9]
Para purificar la toxina B de los cultivos de células de C. difficile , se utiliza un caldo de infusión de cerebro y corazón porque promueve la síntesis de la toxina B. [11] El método de filtración facilita la purificación de la toxina B del sobrenadante de C. difficile . La concentración de toxina del sobrenadante es proporcional al recuento de células del organismo. Muchos estudios han propuesto que la mayoría de las toxinas se liberan en la fase logarítmica tardía o en las fases estacionarias tempranas , por lo que las células secretan continuamente la toxina B. [2] Aunque hay muchos métodos empleados en diferentes estudios para purificar la toxina B, la mayoría de los estudios utilizan métodos que implican concentraciones de sulfato de amonio ultrafiltrado o precipitación , en lugar de la filtración en gel o la cromatografía de intercambio iónico . Además, la eficacia del método de cromatografía de intercambio iónico ayuda a diferenciar entre TcdA y TcdB. [ cita requerida ]
Cuando el residuo catalítico de treonina de la glucosiltransferasa desactiva una familia de pequeñas GTPasas , por ejemplo, la familia Rho ; Rac y Cdc42 dentro de las células diana alteran los mecanismos de transducción de señales , lo que conduce a una disfunción del citoesqueleto de actina , la unión célula - célula y la apoptosis (Fig. 5). [12] [13] [14] Rho induce la actividad de las fibras de estrés de actina . Las proteínas Rac controlan las actividades de rizado de membrana y NADPH -oxidasa de neutrófilos . Cdc42 regula la formación de filamentos de F-actina en filopodios . [ cita requerida ]
Varios estudios han demostrado que la presencia de TcdB en células de mamíferos conduce a cambios rápidos en la morfología celular y la señalización celular . En un corto período de tiempo, las células tienen la apariencia de placa con pequeñas dosis de TcdB y TcdA. Además, la muerte de las células es un impacto importante de estas toxinas después de que las células han sido intoxicadas . Una investigación de Donta et al., adelantó que TcdB tiene graves impactos en otras células de mamíferos como las células de ovario de hámster chino , células epiteliales cervicales humanas , células suprarrenales de ratón , hepatocitos de rata y astrocitos de rata (Fig.3). [15] [16]
La actividad citotóxica depende del tipo de célula, y puede variar entre 4 y 200 veces. Generalmente, cuando las células se infectan con TcdB, no solo pierden su integridad estructural, sino también disminuyen los filamentos de actina F. [17] Los redondeos celulares por TcdB no demoran más de 2 horas (Fig. 4), pero en cuanto a la muerte celular , puede demorar aproximadamente 24 horas. [15] Con respecto a la diarrea asociada a C. difficile (CDAD), los efectos de la citopaticidad son más críticos que la muerte celular real porque una vez que las células pierden la integridad del filamento de actina del citoesqueleto , también pierden su función normal. [ cita requerida ]
La causa de la actividad citotóxica de TcdB dentro de la célula huésped está mediada principalmente por la endocitosis del receptor [ cita requerida ] . Los endosomas ácidos permiten que la toxina B entre en el citosol . Este fenómeno tiene lugar por una región receptora de unión , que permite que la toxina entre en las células huésped [ cita requerida ] . A través de la accesibilidad del citosol de las células huésped , TcdB desactiva las pequeñas GTPasas (Fig. 5), por ejemplo, los miembros de la familia Rho Rac y Cdc42 mediante el proceso de glicosilación de la treonina 35 en Cdc42 y Rac, y la treonina 37 en Rho. [18] [19] Estas Rho GTPasas se encuentran ubicuamente en el citosol de las células eucariotas que son responsables de la organización del citoesqueleto de actina porque las toxinas en el citosol causan condensación de filamentos de actina como consecuencia del redondeo celular y la formación de ampollas en la membrana (Fig. 3), lo que finalmente conduce a la apoptosis . [20] [21] TcdB causa cambios críticos en la dinámica y morfología celular . La Figura 3 muestra el probable efecto de la toxina B en la superficie de una célula; formación de ampollas en la membrana (flechas negras). [22] Además, TcdB inactiva las Rho GTPasas. Como consecuencia, se interrumpen las uniones célula-célula, lo que mejora la permeabilidad epitelial de la toxina B y la acumulación de líquido en el lumen. Este es uno de los principales agentes causantes de contraer diarrea asociada a C. difficile (DACD) (Fig. 5). [23] [24]
Además, la tasa de hidrólisis por TcdB de UDP-glucosa es aproximadamente cinco veces mayor que la de TcdA. [25] Varios estudios han indicado que Rho exhibe modificación postraduccional a través de prenilación y carboximetilación, que ocurre en el lado citoplasmático de la membrana plasmática , de ahí el intercambio de GTP a GDP . [26] Cuando TcdB se une a Rho y otras GTPasas pequeñas , GTP se hidroliza a GDP , lo que lleva a que GTP se una (activo) a GDP (inactivo) (Fig. 5). Además, esta actividad de intercambio está regulada por factores de guanina en el citosol de la célula. [27]
La regulación celular de Rho, Rac y Cdc42 tiene efectos fuera de la vecindad de los filamentos de actina del citoesqueleto (Fig. 4), [17] Estas pequeñas GTPasas se incorporan en el ciclo celular que regula las señales a través de las quinasas de proteína quinasa activadas por mitógenos (MAPKK). [28] Algunas partes fisiológicas de las células que no están involucradas en los filamentos de actina , pueden no causar el redondeo celular o la muerte celular de inmediato, pero en la actividad de la vía descendente, pueden conducir al deterioro de los filamentos de actina y, finalmente, a la muerte celular . [17]
En 1993, un estudio realizado por Shoshan et al., demostró que las células con TcdB cambiaron la actividad de la fosfolipasa A2 . Este fue un evento independiente de la interrupción del citoesqueleto de actina . [29] Shoshan et al., también demostraron que TcdB inhibió la actividad de señalización del receptor al desactivar las proteínas Rho a través de la fosfolipasa D. [29 ]
TcdB accede al interior de la célula a través de endocitosis mediada por clatrina , [30] Cuando la toxina B es parte del citosol , la glucosiltransferasa pasa a través de la membrana endosómica , lo que disminuye el pH, induce la translocación y finalmente conduce a cambios morfológicos de los residuos de la región de translocación (958-1130). [31] Las regiones hidrofóbicas están incrustadas en la membrana del huésped para formar poros que permiten que los dominios de glucosiltransferasa pasen a través de ellas. [31] Cuando las células se infectan con TcdB en un entorno ácido, atenúa las toxinas y provoca reordenamientos de forma (Fig. 6). [31] Como consecuencia del pH ácido, TcdB muestra claras diferencias en la fluorescencia original del triptófano , la susceptibilidad de las proteasas y las superficies hidrofóbicas . [31] Otro grupo ha demostrado que la acidificación conduce a cambios conformacionales de la toxina y, lo que es más importante, ayuda a formar poros. [7] Una supuesta región de translocación (Fig. 2) consta de aproximadamente 801–1400 aminoácidos, de los cuales los residuos 958–1130 son hidrófobos y son responsables de la formación de poros transmembrana. [20] La mayoría de los estudios utilizaron la cepa 630 de TcdB para demostrar la actividad de formación de poros de las toxinas de C. difficile . [31]
Para ver si los efectos de la escisión proteolítica de TcdB tienen lugar en la superficie celular o en endosomas ácidos , los estudios utilizaron Bafilomicina A1 , que se sabe que bloquea las H + -ATPasas de tipo v de los endosomas. Esto reduce la acidez en los endosomas. [31] La vía de absorción fisiológica de TcdB previene la actividad citopática de TcdB. [31] Cuando las células estaban en condiciones ácidas (pH 4,0) durante 5 minutos después de unir TcdB a la superficie celular a 37 grados Celsius, se observaron reordenamientos de forma y redondeo. Sin embargo, cuando las células redondeadas se incubaron durante una hora adicional en pH neutro (7,0) con parámetros similares, no se observó redondeo celular. [15] [31] Ambos estudios mostraron que la toxina B tiene una propiedad de escisión proteolítica , que es fundamental para el acceso al citosol . [7] [15] [31] Tener un pH ácido en los endosomas conduce a alteraciones topológicas de TcdB (Figura 6). [7]
El gen que codifica la proteína TcdB, tcdB , se encuentra dentro de la región cromosómica de 19,6 kb . Esto se conoce como el locus de patogenicidad o PaLoc (Figura 2). [32] [33] El marco de lectura abierto (ORF) para tcdB tiene una longitud de 7.098 nucleótidos . [17] Es importante mencionar que, además de los principales genes de toxinas en la región PaLoc, hay otros tres genes accesorios que codifican en la región PaLoc: tcdR (L), tcdC (R) y tcdE en el medio. Estos genes ayudan a regular la expresión de TcdA y TcdB. También ayudan a secretar o liberar las toxinas de la célula. [17] El gen codificador tcdE , ubicado entre tcdB y tcdA, es análogo a las proteínas holinas , por lo tanto, se sugiere que tcdE funciona como un gen facilitador que mejora la liberación o secreción de TcdA y TcdB aumentando en consecuencia la permeabilidad de la membrana de la célula huésped . [17]
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Existen diferentes tamaños de plásmidos de C. difficile . Los pesos moleculares detectados varían de 2,7x10 6 a 100x10 6 , pero los tamaños de plásmidos no muestran correlación con la toxicidad . Para detectar el nivel de toxina B en C. difficile , los médicos utilizan ampliamente ensayos de cultivo celular derivados de muestras de heces de pacientes con PMC . [2] [3] El ensayo de cultivo celular se considera un "estándar de oro" para detectar la toxicidad en C. difficile porque una pequeña cantidad de toxina B es capaz de causar redondeo celular (Fig. 4), por lo tanto, es una gran ventaja para los laboratorios clínicos hacer correlaciones con la CDAD causada por TcdB. [2] [3] Aunque se encontró actividad citotóxica de toxinas clostridiales grandes (LCT) en muestras de heces de pacientes con PMC, la actividad de la toxina B tuvo efectos citotóxicos más perjudiciales en comparación con la toxina A. [2] Por lo tanto, la actividad de la toxina A se atenúa cuando no se aísla de la toxina B. [2] [3] La detección de la toxicidad de C. difficile es extremadamente sensible, sin embargo, el uso del ensayo de cultivo celular permite a los laboratorios clínicos superar el desafío; el uso de dosis tan pequeñas como 1 pg/mL de toxina B es suficiente para causar redondeo celular. [2] [3] Esta es la principal ventaja de utilizar el ensayo de cultivo de tejido para detectar toxicidad en pacientes con PMC . [2] Aunque los laboratorios clínicos han intentado utilizar un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) en placa de microtitulación y otras técnicas para detectar la actividad citotóxica de la toxina B en las heces de pacientes con PMC , los resultados no son tan precisos como aquellos en los que se utilizaron ensayos de cultivo celular . [2] [3] [34]
Al agregar antimicrobianos , por ejemplo clindamicina , al medio de cultivo, los estudios han demostrado que la actividad citotóxica en cultivos de C. difficile aumenta de 4 a 8 veces. [35] [36] Además, conociendo el papel de los antibióticos en las causas de PMC, muchos estudios anteriores se centraron en los efectos de la producción de toxinas por parte de los antimicrobianos . Como resultado, los estudios pudieron concluir que la naturaleza subinhibitoria de los niveles de vancomicina y penicilina aumentaba la producción de toxinas en cultivos de C. difficile . [37] Las cantidades de producción de toxinas se correlacionaron con el uso del medio de crecimiento para los organismos. Otro estudio ilustró que se observaron altos niveles de producción de toxinas de TcdB en medios complejos como el caldo de infusión de cerebro y corazón . [38] [39] Se produjeron altos niveles de toxinas con el aislamiento de altamente virulentos . Por el contrario, se produjeron bajos niveles de toxinas con el aislamiento de débilmente virulentos . Por lo tanto, se demuestra que la producción de toxinas estaba co-regulada. Aunque no se entiende el mecanismo detrás de la participación del medio ambiente en la modulación de las señales que expresan las toxinas, los estudios in vitro han demostrado que la expresión de la toxina se ve reforzada por la represión de catabolitos y el estrés, por ejemplo, los antibióticos . [40] [41] [42] Otro estudio ha demostrado que limitar la biotina en un medio bien caracterizado aumenta la producción de TcdB en 64 veces y la de TcdA en 35 veces. Esto se hizo con C. difficile y dosis de biotina tan pequeñas como 0,05 nM. [41] Varios otros estudios tempranos han argumentado en contra de la teoría de que la producción de toxina tiene algo que ver con el estrés o la represión de catabolitos de la toxina TcdA o TcdB. [42] Además, muchos estudios dicen que la razón principal de las diferencias entre otros estudios se debe a que la producción de toxina no ocurre con todos los aislados de C. difficile . [ cita requerida ]
Muchos estudios iniciales han sugerido que la toxina A (también conocida como TcdA) es la principal proteína toxina que causa diarrea asociada a antibióticos (DAA); sin embargo, los científicos investigadores de la última década han demostrado que la toxina B (o TcdB) desempeña un papel más importante en la enfermedad de lo que nadie había previsto. Con este conocimiento, la toxina B ha sido identificada como el principal factor de virulencia que causa la apertura de las uniones estrechas de las células epiteliales intestinales , lo que permite que la toxina aumente la permeabilidad vascular e induzca hemorragias . Por lo tanto, esto lleva a que el factor de necrosis tumoral α (TNF α) y las interleucinas proinflamatorias se establezcan como los principales agentes causantes de la colitis pseudomembranosa (PMC) y la diarrea asociada a antibióticos (DAA). [2] [3] [43]
La participación de la toxina A y, lo más importante, la toxina B es el elemento clave que determina la enfermedad causada por C. difficile . Los laboratorios clínicos han identificado estas toxinas en las heces de los pacientes basándose en ensayos de anticuerpos y citotoxicidad . [44] Se ha demostrado que estas toxinas bacterianas están asociadas con la toxina hemorrágica de Clostridium sordellii (TcsH), la toxina letal (TcsL) y la toxina alfa de Clostridium novyi (Tcn α), lo que hace que esta cohorte sea la gran familia de toxinas clostridiales. [17] Debido a las similitudes de estas toxinas con otras, los investigadores las han clasificado como la familia de las grandes toxinas clostridiales (LCT). [9]
Bezlotoxumab es un anticuerpo monoclonal humano diseñado para la prevención de la recurrencia de infecciones por Clostridium difficile. Mediante la estructura cristalizada por rayos X del extremo N de TcdB, se identifica que la toxina consta de tres dominios: un dominio de glucosiltransferasa (GTD), una proteasa de cisteína y un dominio de oligopéptido repetitivo combinado (CROP). Bezlotoxumab se une específicamente a dos sitios homólogos dentro del dominio CROP de TcdB. El análisis estructural por cristalografía de rayos X indica que la unión del anticuerpo ocluye parcialmente los supuestos bolsillos de unión de carbohidratos. En consonancia con esta idea, Bezlotoxumab bloquea la unión de TcdB a las células de mamíferos. [45]
En las primeras etapas de la enfermedad de PMC , muchos estudios han especulado que TcdA es más potente que TcdB. Esto se ha deducido de experimentos in vivo donde las producciones de toxina de TcdA fueron más severas que TcdB con antibióticos cecitis. [38] [46] Más tarde, varios estudios mostraron que TcdB juega un papel importante en la enfermedad de PMC y ADD. El estudio demostró que aunque C. difficile no produce TcdA, todavía muestra síntomas de la enfermedad. [47] Además, estudios posteriores han demostrado que una forma purificada de TcdB es una enterotoxina más letal en comparación con TcdA, y también, que el epitelio intestinal está severamente dañado y causa una respuesta inflamatoria aguda. [48] Con una mejor comprensión de la toxina, los investigadores pudieron afirmar que TcdB es el principal factor de virulencia que causa CDI sobre TcdA. Sin embargo, cuando el TcdA está presente en el intestino, ayuda a facilitar que la actividad del TcdB tenga impactos más amplios, afectando en consecuencia a múltiples sistemas orgánicos. [49] Además, cuando se vacunó a los hámsteres contra el TcdA, se demostró que no estaban completamente protegidos de la enfermedad por C. difficile y esto llevó a los estudios a concluir que el TcdB es muy letal y potente. [50] Además, inyectar una pequeña dosis de TcdA con una dosis letal de TcdB por vía intravenosa o intraperitoneal resultó suficiente para causar la muerte de un animal. Por lo tanto, el TcdA funciona como un facilitador de la salida del TcdB del intestino. [50]