Las bafilomicinas son una familia de antibióticos macrólidos producidos a partir de una variedad de Streptomycetes . Su estructura química está definida por un andamiaje de anillo de lactona de 16 miembros. [2] Las bafilomicinas exhiben una amplia gama de actividad biológica , incluyendo actividad antitumoral, [3] antiparasitaria, [4] [5] inmunosupresora [6] y antifúngica [7] . La bafilomicina más utilizada es la bafilomicina A1, un potente inhibidor de la autofagia celular . También se ha descubierto que las bafilomicinas actúan como ionóforos , transportando potasio K+ a través de las membranas biológicas y provocando daño mitocondrial y muerte celular. [8]
La bafilomicina A1 se dirige específicamente a la enzima H + -ATPasa de tipo vacuolar (V-ATPasa), una bomba de protones que atraviesa la membrana y que acidifica el entorno extracelular o los orgánulos intracelulares, como el lisosoma de las células animales o la vacuola de las plantas y los hongos. [9] En concentraciones micromolares más altas, la bafilomicina A1 también actúa sobre las ATPasas de tipo P , que tienen un estado de transición fosforilado. [2] [10]
La bafilomicina A1 sirve como un compuesto herramienta importante en muchas aplicaciones de investigación in vitro ; sin embargo, su uso clínico está limitado por un perfil de toxicidad sustancial. [11]
La bafilomicina A1, B1 y C1 se aislaron por primera vez de Streptomyces griseus en 1983. [11] Durante una búsqueda de metabolitos secundarios microbianos cuya actividad imitara la de dos glucósidos cardíacos , se identificó a la bafilomicina C1 como un inhibidor de la P-ATPasa con un ak i de 11 μM. Se descubrió que la bafilomicina C1 tenía actividad contra Caenorhabditis elegans , garrapatas y tenias, además de estimular la liberación de ácido γ-aminobutírico ( GABA ) de los sinaptosomas de rata . Independientemente, la bafilomicina A1 y otros derivados se aislaron de S. griseus y se demostró que tenían actividad antibiótica contra algunas levaduras, bacterias grampositivas y hongos. [12] También se demostró que la bafilomicina A1 tenía un efecto antiproliferativo en las células T estimuladas con concanavalina-A . Sin embargo, su alta toxicidad ha impedido su uso en ensayos clínicos. [2]
Dos años más tarde, también se aislaron bafilomicinas D y E de S. griseus . En 2010, se identificaron 9-hidroxi-bafilomicina D, 29-hidroxi-bafilomicina D y otras bafilomicinas del microorganismo endofítico Streptomyces sp. YIM56209. [13] De 2004 a 2011, se aislaron bafilomicinas FK de otras especies de Streptomyces . [11]
La bafilomicina A1 es una de las primeras sustancias identificadas y de uso más frecuente, y tiene una importancia especial, sobre todo porque su estructura es el núcleo de todas las demás bafilomicinas. Debido a su gran estructura, la bafilomicina tiene múltiples centros quirales y grupos funcionales, lo que dificulta la modificación de su estructura, una tarea que se ha intentado para reducir la toxicidad asociada al compuesto. [11]
Dentro de la célula, la bafilomicina A1 interactúa específicamente con la bomba de protones V-ATPasa. Esta gran proteína depende de la hidrólisis del trifosfato de adenosina (ATP) para bombear protones a través de una membrana biológica. [3] Cuando la bafilomicina y otros inhibidores de la V-ATPasa, como la concanamicina, se descubrieron por primera vez en la década de 1980, se utilizaron para establecer la presencia de la V-ATPasa en tipos de células y tejidos especializados, caracterizando la distribución de la bomba de protones. [14] Estructuralmente, la V-ATPasa consta de 13 subunidades distintas que juntas forman los dominios V o que abarcan la membrana y V 1 citosólico de la enzima. [3] El dominio V 1 en el citosol está formado por las subunidades A a H, mientras que el dominio V o está formado por las subunidades a, d, e, c y c". [15]
Para mover protones a través de la membrana, un protón primero ingresa a la subunidad a dentro del dominio V o a través de un hemicanal citoplasmático. Esto permite que los residuos de ácido glutámico conservados dentro del anillo proteolipídico de las subunidades c y c" de V o se protone. Luego, el dominio V 1 de la enzima hidroliza el trifosfato de adenosina (ATP) , lo que permite tanto la rotación del tallo central de la bomba, formado por las subunidades D, F y d, como la rotación del anillo proteolipídico. Esta rotación pone a los residuos de ácido glutámico protonados en contacto con un hemicanal luminal ubicado en la subunidad a. Dentro de la subunidad a, los residuos de arginina sirven para estabilizar la forma desprotonada del ácido glutámico y permiten la liberación de sus protones. Esta rotación y transferencia de protones lleva a los protones a través de la bomba y a través de la membrana. [3] [15]
Durante más de diez años después de que se descubriera que la bafilomicina era un inhibidor de la V-ATPasa, el sitio de su interacción con la V-ATPasa no estaba claro. Los estudios iniciales utilizaron la V-ATPasa del gránulo cromafín para sugerir que la bafilomicina interactuaba con el dominio V o . Dos estudios posteriores confirmaron esta hipótesis utilizando la V-ATPasa de vesículas recubiertas de clatrina bovina . Demostraron que la aplicación de bafilomicina inhibía el flujo de protones a través de V o y que esta inhibición podía superarse añadiendo de nuevo el dominio V o a las vesículas recubiertas. Al limitar aún más el sitio de interacción de la bafilomicina, descubrieron que la adición específica de solo la subunidad a de V o podía restaurar la función. Esto sugirió que la bafilomicina interactuaba específicamente con la subunidad a de la V-ATPasa; sin embargo, otro estudio contradijo este hallazgo. Un grupo descubrió que al utilizar una columna de cromatografía de afinidad de bafilomicina, la V-ATPasa podía purificarse y que la adición de DCCD, un inhibidor de la subunidad V o c, reducía drásticamente la afinidad de la bafilomicina por la V-ATPasa. Esto sugirió que la bafilomicina interactuaba más fuertemente con la subunidad c del dominio V o . Se descubrió además que los cambios de aminoácidos dentro de la subunidad a también podían reducir la interacción V-ATPasa-Bafilomicina, lo que indica un papel menor de la subunidad a en la unión de la bafilomicina además de la subunidad c. [14] Un análisis de nueve mutaciones que conferían resistencia a la bafilomicina mostró que todas ellas cambiaban aminoácidos en la subunidad V o c. Estos datos sugirieron que el sitio de unión de la bafilomicina estaba en la superficie exterior del dominio Vo, en la interfaz entre dos subunidades c. [16] [17] Este sitio de unión ha sido descrito recientemente en alta resolución por dos grupos que utilizaron criomicroscopía electrónica para obtener estructuras de la V-ATPasa unida a bafilomicina. [18] [19]
En general, la bafilomicina se une con una eficiencia nanomolar a la subunidad V o c del complejo V-ATPasa e inhibe la translocación de protones. [15] Aunque la interacción entre la bafilomicina y la V-ATPasa no es covalente, su baja constante de disociación de aproximadamente 10 nM describe la fuerza de su interacción y puede hacer que los efectos de la bafilomicina sean difíciles de revertir. [20]
La V-ATPasa es ubicua en las células de mamíferos y desempeña un papel importante en muchos procesos celulares. Se localiza en la red trans-golgi y los orgánulos celulares que se derivan de ella, incluidos los lisosomas, las vesículas secretoras y los endosomas . [21] La V-ATPasa también se puede encontrar dentro de la membrana plasmática . En los mamíferos, la ubicación de la V-ATPasa puede vincularse a la isoforma específica de la subunidad a que tiene el complejo. Las isoformas a1 y a2 dirigen la V-ATPasa intracelularmente, a las vesículas sinápticas y los endosomas respectivamente. Sin embargo, las subunidades a3 y a4 median la localización de la V-ATPasa en la membrana plasmática en los osteoclastos (a3) y las células intercaladas renales (a4). Si se encuentra en la membrana lisosómica, esto da como resultado la acidificación del lisosoma a medida que se reduce el pH luminal, lo que permite la actividad de las hidrolasas lisosómicas. Cuando la V-ATPasa se encuentra en la membrana plasmática, la extrusión de protones a través de la bomba provoca la acidificación del espacio extracelular, que es utilizado por células especializadas como los osteoclastos, las células claras del epidídimo y las células intercaladas del epitelio renal. [3]
Dado que promueve la acidificación de lisosomas, endosomas y vesículas secretoras, la V-ATPasa contribuye a procesos que incluyen: [ cita requerida ]
La V-ATPasa, que desempeña un papel en la acidificación lisosomal, también es crucial para impulsar el transporte de iones y moléculas pequeñas al citoplasma, en particular calcio y aminoácidos. Además, su acidificación de los endosomas es fundamental para la endocitosis de los receptores, ya que un pH bajo tiende a impulsar la liberación de ligandos, así como la escisión del receptor, lo que contribuye a los eventos de señalización, como la liberación del dominio intracelular de Notch . [3]
Cuando se encuentra en la membrana plasmática, la función de la V-ATPasa es fundamental para la acidificación del entorno extracelular, lo que se observa en los osteoclastos y las células claras del epidídimo. Cuando está presente en la membrana plasmática de las células intercaladas del epitelio renal, la V-ATPasa es importante para la secreción ácida, lo que contribuye a la acidificación de la orina. En respuesta a la reducción del pH plasmático, los niveles elevados de V-ATPasa suelen ser transportados a la membrana plasmática de estas células mediante la fosforilación de la bomba por la proteína quinasa A (PKA). [3]
Clínicamente, la disfunción de la V-ATPasa se ha correlacionado con varias enfermedades en humanos. Algunas de estas enfermedades incluyen infertilidad masculina , osteopetrosis y acidosis renal. [14] Además, la V-ATPasa se puede encontrar en la membrana plasmática de algunas células cancerosas invasivas, incluido el cáncer de mama, próstata y hígado, entre otros. En muestras de cáncer de pulmón humano, la expresión de V-ATPasa se correlacionó con la resistencia a los fármacos . [15] También se ha identificado una gran cantidad de mutaciones de la subunidad de V-ATPasa en varios cánceres, incluidos los linfomas foliculares . [3]
Como objetivo de la Bafilomicina V-ATPasa, está involucrado en muchos aspectos de la función celular, el tratamiento con Bafilomicina altera en gran medida los procesos celulares. [ cita requerida ]
La bafilomicina A1 es más conocida por su uso como inhibidor de la autofagia. [12] [22] La autofagia es el proceso por el cual la célula degrada sus propios orgánulos y algunas proteínas a través de la formación de autofagosomas . Luego, los autofagosomas se fusionan con los lisosomas, lo que facilita la degradación de la carga engullida por las proteasas lisosomales. Este proceso es fundamental para mantener el almacenamiento de aminoácidos y otros nutrientes de la célula durante períodos de privación de nutrientes u otros estreses metabólicos. [23] La bafilomicina interfiere con este proceso al inhibir la acidificación del lisosoma a través de su interacción con la V-ATPasa. La falta de acidificación lisosomal impide la actividad de las proteasas lisosomales como las catepsinas, de modo que la carga engullida ya no se puede degradar. [22]
Dado que la V-ATPasa se distribuye ampliamente dentro de la célula, la bafilomicina solo es específica como inhibidor de la autofagia durante un breve período de tiempo. Se observan otros efectos fuera de este breve período, incluida la interferencia en el tráfico de endosomas y la inhibición proteosomal. [22]
Además de bloquear la acidificación del lisosoma, se ha informado que la bafilomicina bloquea la fusión de los autofagosomas con los lisosomas. [12] Esto se encontró inicialmente en un artículo de Yamamoto, et al. en el que los autores utilizaron bafilomicina A1 para tratar células de hepatoma de rata H-4-II-E. Mediante microscopía electrónica , vieron un bloqueo de la fusión autofagosoma-lisosoma después de usar bafilomicina a una concentración de 100 nM durante 1 hora. Esto ha sido confirmado por otros estudios, particularmente dos que encontraron una disminución de la colocalización de mitocondrias y lisosomas mediante microscopía de fluorescencia después de un tratamiento de 12 a 24 horas con 100 o 400 nM de bafilomicina. Sin embargo, estudios posteriores no han podido ver esta inhibición de la fusión con tratamientos similares con bafilomicina. Estos resultados contradictorios se han explicado por las diferencias de tiempo entre los tratamientos, así como por el uso de diferentes líneas celulares. El efecto de la bafilomicina en la fusión autofagosoma-lisosoma es complejo y depende del tiempo en cada línea celular. [8] [24]
En las neuronas , se ha observado un aumento del marcador del autofagosoma LC3-II con el tratamiento con bafilomicina. Esto ocurre porque los autofagosomas no se fusionan con los lisosomas, lo que normalmente estimula la degradación del LC3-II. [25]
En las células PC12 , se descubrió que la bafilomicina induce apoptosis o muerte celular programada. [20] Además, en algunas líneas celulares se ha descubierto que altera el gradiente electroquímico de las mitocondrias e induce la liberación de citocromo c , que es un iniciador de la apoptosis. [8] También se ha demostrado que la bafilomicina induce tanto la inhibición de la autofagia como la posterior inducción de la apoptosis en células de osteosarcoma [26] así como en otras líneas de células cancerosas. [3]
La bafilomicina actúa como un ionóforo , lo que significa que puede transferir iones K + a través de las membranas biológicas. [14] Normalmente, la membrana interna mitocondrial no es permeable al K + y mantiene un gradiente electroquímico establecido. En las células excitables, las mitocondrias pueden contener un canal de K + que, cuando se abre, puede causar estrés mitocondrial al inducir la hinchazón mitocondrial, cambiar el gradiente electroquímico y estimular la respiración. El tratamiento con bafilomicina A1 puede inducir la hinchazón mitocondrial en presencia de iones K + , estimular la oxidación de nucleótidos de pirimidina y desacoplar la fosforilación oxidativa . Se descubrió que las concentraciones ascendentes de bafilomicina aumentaban linealmente la cantidad de K + que atravesaba la membrana mitocondrial, lo que confirma que actúa como un ionóforo. Sin embargo, en comparación con otros ionóforos, la bafilomicina tiene una baja afinidad por el K + . [8]
En muchos tipos de cáncer, se ha descubierto que varias subunidades de la V-ATPasa están reguladas positivamente. [15] La regulación positiva de estas subunidades parece estar correlacionada con un aumento de la metástasis de las células tumorales y una reducción de los resultados clínicos. Se ha demostrado que la aplicación de bafilomicina reduce el crecimiento celular en varias líneas celulares cancerosas en múltiples tipos de cáncer mediante la inducción de la apoptosis. Además, el efecto antiproliferativo de la bafilomicina in vitro parece ser específico de las células cancerosas en lugar de las células normales, lo que se observa con la inhibición selectiva del crecimiento de las células del hepatoblastoma en comparación con los hepatocitos sanos. [3]
El mecanismo por el cual la bafilomicina causa este efecto antiproliferativo específico del cáncer es multifactorial. Además de la inducción de la apoptosis dependiente de la caspasa a través de la vía mitocondrial, la bafilomicina también provoca un aumento de los niveles de especies reactivas de oxígeno y un aumento de la expresión de HIF1alfa. Estos efectos sugieren que la inhibición de la V-ATPasa con bafilomicina puede inducir una respuesta de estrés celular, incluida la autofagia y la apoptosis final. Estos efectos algo contradictorios de la inhibición de la V-ATPasa en términos de inhibición o inducción de la apoptosis demuestran que la función de la bafilomicina depende críticamente del contexto celular y puede mediar un fenotipo pro-supervivencia o pro-muerte. [3] [24]
La bafilomicina in vivo redujo el volumen tumoral promedio en los modelos de ratones con xenoinjerto MCF-7 y MDA-MB-231 en un 50% y no mostró efectos tóxicos con una dosis de 1 mg/kg. Además, cuando se combinó con sorafenib , la bafilomicina también provocó la regresión tumoral en ratones con xenoinjerto MDA-MB-231. En un modelo de xenoinjerto de carcinoma hepatocelular ortotrópico HepG2 en ratones desnudos, la bafilomicina previno el crecimiento tumoral. [3]
Se cree que la desregulación de la V-ATPasa desempeña un papel en la resistencia a las terapias contra el cáncer, ya que la acidificación aberrante del entorno extracelular puede protonar los agentes quimioterapéuticos, impidiendo su entrada en la célula. [3] [15] No está claro si la desregulación de la V-ATPasa es una causa directa del mal resultado clínico asociado o si su desregulación afecta principalmente la respuesta al tratamiento. Aunque el tratamiento con bafilomicina y cisplatino tuvo un efecto sinérgico sobre la citotoxicidad de las células cancerosas. [3]
Se ha demostrado que las bafilomicinas inhiben la ATPasa de la membrana plasmática (P-ATPasa), así como los transportadores del casete de unión a ATP (ABC). Estos transportadores se identifican como buenos objetivos antifúngicos, ya que hacen que los organismos sean incapaces de hacer frente al estrés catiónico. [7] Cuando se trató a Cryptococcus neoformans con bafilomicina, se observó inhibición del crecimiento. [27] La bafilomicina también se ha utilizado en C. neoformans junto con el inhibidor de calcineurina FK506, mostrando una actividad antifúngica sinérgica. [7]
Se ha demostrado que la bafilomicina es activa contra Plasmodium falciparum , el agente causante de la malaria. Tras la infección de los glóbulos rojos , P. falciparum exporta una red de membranas al citoplasma del glóbulo rojo y también inserta varias de sus propias proteínas en la membrana del huésped, incluida su propia V-ATPasa. Esta bomba de protones tiene una función en el mantenimiento del pH intracelular del glóbulo rojo infectado y facilita la absorción de pequeños metabolitos en equilibrio. El tratamiento del glóbulo rojo parasitado con bafilomicina previene la acidificación extracelular, lo que provoca una caída del pH intracelular alrededor del parásito de la malaria. [4] [5]
La bafilomicina A1 y la bafilomicina D han demostrado propiedades antivirales contra el SARS-CoV-2 , el virus que causa la COVID-19 . [28] [29] [30] [31] La bafilomicina A1 también ha demostrado propiedades antivirales contra el virus Zika . [32]
La miopatía inflamatoria, miositis por cuerpos de inclusión (IBM), es relativamente común en pacientes mayores de 50 años y consiste en una sobreactivación del flujo autofágico. En esta afección, el aumento de la autofagia da lugar a un aumento de la degradación de proteínas y, por lo tanto, a un aumento de la presentación de péptidos antigénicos en los músculos. Esto puede provocar una sobreactivación de las células inmunitarias. El tratamiento con bafilomicina puede prevenir la acidificación de los lisosomas y, por lo tanto, la autofagia, disminuyendo la cantidad de péptidos antigénicos digeridos y expuestos al sistema inmunitario. [6]
En pacientes con lupus , se ha descubierto que la vía de autofagia está alterada tanto en las células B como en las T. En particular, se observaron más vacuolas autofágicas en las células T, así como un aumento de la tinción de LC3-11 para los autofagosomas, lo que indica un aumento de la autofagia. También se puede observar un aumento de la autofagia en subconjuntos de células B de pacientes sin tratamiento previo. El tratamiento con bafilomicina A1 redujo la diferenciación de los plasmoblastos y disminuyó su supervivencia. [33]
Las enfermedades neurodegenerativas suelen presentar niveles elevados de agregados proteicos dentro de la célula que contribuyen a la disfunción de las neuronas y a su posterior muerte. Como método de degradación de proteínas dentro de la célula, la autofagia puede transportar estos agregados proteicos para que se degraden en el lisosoma. Aunque no está claro el papel exacto que desempeña la autofagia continua, o flujo autofágico, en la homeostasis neuronal y los estados patológicos, se ha demostrado que la disfunción autofágica puede observarse en las enfermedades neurodegenerativas. [25]
La bafilomicina se utiliza habitualmente para estudiar este flujo autofágico en las neuronas, entre otros tipos de células. Para ello, las neuronas se colocan primero en condiciones ricas en nutrientes y luego en condiciones de carencia de nutrientes para estimular la autofagia. La bafilomicina se administra simultáneamente en condiciones de estrés nutricional de modo que, mientras se estimula la autofagia, la bafilomicina bloquea su etapa final de fusión autofagosoma-lisosomal, lo que da lugar a la acumulación de autofagosomas. A continuación, se pueden controlar los niveles de proteínas relacionadas con la autofagia asociadas a los autofagosomas, como LC3, para determinar el nivel de formación de autofagosomas inducido por la privación de nutrientes. [25]
Algunos fármacos catiónicos, como la cloroquina y la sertralina , se conocen como fármacos lisosomotrópicos. Estos fármacos son bases débiles que se protonan en el entorno ácido del lisosoma. Esto atrapa el compuesto que de otro modo no estaría protonado dentro del lisosoma, ya que la protonación impide su paso de regreso a través de la membrana lipídica del orgánulo. Este fenómeno se conoce como atrapamiento de iones . El atrapamiento del compuesto catiónico también atrae agua al lisosoma a través de un efecto osmótico, que a veces puede provocar la vacuolización observada en células cultivadas in vitro . [21] [34]
Cuando uno de estos fármacos se coaplica a las células con bafilomicina A1, la acción de la bafilomicina A1 evita la acidificación del lisosoma, previniendo así el fenómeno de atrapamiento de iones en este compartimento. [34] Como el lisosoma no puede acidificarse, los fármacos lisosomotrópicos no se protonan y posteriormente quedan atrapados en el lisosoma en presencia de bafilomicina. Además, cuando las células se precargan con fármacos lisosomotrópicos in vitro y luego se tratan con bafilomicina, la bafilomicina actúa para liberar el compuesto catiónico de su acumulación en el lisosoma. [21]
El pretratamiento de células con bafilomicina antes de la administración de un fármaco catiónico puede alterar la cinética del compuesto catiónico. En un ensayo de contractilidad en conejos, se utilizó bafilomicina para pretratar la aorta aislada de conejo . El agente lipofílico xilometazolina , un agonista de los receptores alfa-adrenérgicos , mostró un mayor efecto cuando se administró después del tratamiento con bafilomicina. Con bafilomicina, se observó una contracción y relajación más rápidas de la aorta, ya que la bafilomicina impidió el atrapamiento de iones de xilometazolina en el lisosoma. Sin un pretratamiento con bafilomicina, la V-ATPasa funcional hace que el lisosoma se convierta en un reservorio de xilometazolina, lo que ralentiza su efecto sobre la contractilidad. [21]
Como fármaco lisosomotrópico, la cloroquina se acumula típicamente en los lisosomas, alterando su función degradativa, inhibiendo la autofagia e induciendo la apoptosis a través de mecanismos dependientes de Bax. Sin embargo, en neuronas granulares cerebelosas cultivadas (CGN), el tratamiento con bafilomicina en dosis bajas de 1 nM disminuyó la apoptosis inducida por cloroquina sin afectar la inhibición de la autofagia por esta última. Se desconoce el mecanismo exacto de esta protección, aunque se plantea la hipótesis de que se produce después de la fusión autofagosoma-lisosoma pero antes de la inducción de la apoptosis por Bax. [12]
Se ha demostrado que la bafilomicina potencia el efecto del taxol en la disminución de los niveles de metaloproteasa de matriz (MMP) al reducir la función protectora mitocondrial de Bcl-xL. Además, en las células resistentes al cisplatino , se encontró que la expresión de V-ATPasa aumentaba, y el tratamiento conjunto de bafilomicina con cisplatino sensibilizó a estas células a la citotoxicidad inducida por cisplatino. [3] También se ha demostrado que la bafilomicina aumenta la eficacia de los inhibidores de EGFR en aplicaciones anticancerígenas. [35]