RNA-Seq (llamado así como una abreviatura de RNA sequencing ) es una técnica que utiliza secuenciación de próxima generación para revelar la presencia y cantidad de moléculas de ARN en una muestra biológica, proporcionando una instantánea de la expresión genética en la muestra, también conocida como transcriptoma . [2] [3]
Específicamente, RNA-Seq facilita la capacidad de observar transcripciones empalmadas de genes alternativos , modificaciones postranscripcionales , fusión de genes , mutaciones/ SNP y cambios en la expresión genética a lo largo del tiempo, o diferencias en la expresión genética en diferentes grupos o tratamientos. [4] Además de las transcripciones de ARNm, RNA-Seq puede analizar diferentes poblaciones de ARN para incluir ARN total, ARN pequeño, como miARN , ARNt y perfiles ribosómicos . [5] RNA-Seq también se puede utilizar para determinar los límites de exón / intrón y verificar o modificar los límites de los genes 5' y 3' previamente anotados . Los avances recientes en RNA-Seq incluyen secuenciación de células individuales , secuenciación de ARN en masa [6] , secuenciación in situ de tejido fijado y secuenciación de moléculas de ARN nativas con secuenciación en tiempo real de una sola molécula. [7] Otros ejemplos de aplicaciones emergentes de RNA-Seq debido al avance de los algoritmos bioinformáticos son la alteración del número de copias, la contaminación microbiana, los elementos transponibles, el tipo de célula (deconvolución) y la presencia de neoantígenos. [8]
Los pasos generales para preparar una biblioteca de ADN complementario (ADNc) para la secuenciación se describen a continuación, pero a menudo varían entre plataformas. [10] [3] [11]
Aislamiento de ARN: el ARN se aísla del tejido y se mezcla con desoxirribonucleasa (DNasa). La ADNasa reduce la cantidad de ADN genómico. La cantidad de degradación del ARN se verifica con gel y electroforesis capilar y se utiliza para asignar un número de integridad del ARN a la muestra. Esta calidad del ARN y la cantidad total de ARN inicial se tienen en cuenta durante los pasos posteriores de preparación, secuenciación y análisis de la biblioteca.
Selección/agotamiento de ARN: para analizar señales de interés, el ARN aislado puede mantenerse tal como está, enriquecerse con ARN con colas 3' poliadeniladas (poli(A)) para incluir solo ARNm eucariota , empobrecerse de ARN ribosomal (ARNr) y /o filtrado para ARN que se une a secuencias específicas ( tabla de métodos de selección y agotamiento de ARN , a continuación). Las moléculas de ARN que tienen colas 3' poli(A) en eucariotas se componen principalmente de secuencias codificantes maduras y procesadas. La selección de poli(A) se realiza mezclando ARN con oligómeros de poli(T) unidos covalentemente a un sustrato, normalmente perlas magnéticas. [12] [13] La selección de poli(A) tiene limitaciones importantes en la detección de biotipos de ARN. Muchos biotipos de ARN no están poliadenilados, incluidos muchos ARN no codificantes y transcripciones de proteínas con núcleo de histonas, o están regulados a través de la longitud de su cola poli(A) (p. ej., citoquinas) y, por lo tanto, es posible que no se detecten después de la selección poli(A). [14] Además, la selección poli(A) puede mostrar un mayor sesgo 3', especialmente con ARN de menor calidad. [15] [16] Estas limitaciones se pueden evitar con el agotamiento ribosómico, eliminando el ARNr que normalmente representa más del 90% del ARN de una célula. Tanto el enriquecimiento con poli(A) como el agotamiento ribosomal requieren mucha mano de obra y podrían introducir sesgos, por lo que se han desarrollado enfoques más simples para omitir estos pasos. [17] Los objetivos de ARN pequeños, como los miARN , se pueden aislar aún más mediante la selección de tamaño con geles de exclusión, perlas magnéticas o kits comerciales.
Síntesis de ADNc: el ARN se transcribe de forma inversa a ADNc porque el ADN es más estable y para permitir la amplificación (que utiliza ADN polimerasas ) y aprovechar una tecnología de secuenciación de ADN más madura. La amplificación posterior a la transcripción inversa da como resultado la pérdida de cadena , que puede evitarse con marcaje químico o secuenciación de una sola molécula. La fragmentación y la selección de tamaño se realizan para purificar secuencias que tienen la longitud adecuada para la máquina secuenciadora. El ARN, el ADNc o ambos se fragmentan con enzimas, sonicación o nebulizadores. La fragmentación del ARN reduce el sesgo 5' de la transcripción inversa cebada aleatoriamente y la influencia de los sitios de unión del cebador , [13] con la desventaja de que los extremos 5' y 3' se convierten en ADN de manera menos eficiente. A la fragmentación le sigue la selección de tamaño, donde se eliminan secuencias pequeñas o se selecciona un rango reducido de longitudes de secuencia. Debido a que los ARN pequeños como los miARN se pierden, estos se analizan de forma independiente. El ADNc de cada experimento se puede indexar con un código de barras de hexámero u octámero, de modo que estos experimentos se puedan agrupar en un solo carril para la secuenciación multiplexada.
Secuenciación complementaria de ADN (cDNA-Seq)
Luego, la biblioteca de ADNc derivada de biotipos de ARN se secuencia en un formato legible por computadora. Existen muchas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para la secuenciación de ADNc, incluidas plataformas desarrolladas por Illumina , Thermo Fisher , BGI/MGI , PacBio y Oxford Nanopore Technologies . [18] Para la secuenciación de lectura corta de Illumina, una tecnología común para la secuenciación de ADNc, se ligan adaptadores al ADNc, se une el ADN a una celda de flujo, se generan grupos a través de ciclos de amplificación y desnaturalización de puentes, y se secuencia por síntesis. realizado en ciclos de síntesis de hebras complementarias y excitación láser de bases con terminadores reversibles. La elección y los parámetros de la plataforma de secuenciación se guían por el diseño y el costo experimentales. Las consideraciones comunes del diseño experimental incluyen decidir sobre la longitud y la profundidad de la secuenciación, el uso de secuenciación de extremo único versus secuenciación de extremo emparejado, número de réplicas, multiplexación, aleatorización y picos. [19]
Secuenciación de ARN pequeño/ARN no codificante
Al secuenciar ARN distinto del ARNm, se modifica la preparación de la biblioteca. El ARN celular se selecciona en función del rango de tamaño deseado. Para dianas de ARN pequeñas, como miARN , el ARN se aísla mediante selección de tamaño. Esto se puede realizar con un gel de exclusión de tamaño, mediante perlas magnéticas de selección de tamaño o con un kit desarrollado comercialmente. Una vez aislados, se añaden conectores al extremo 3' y 5' y luego se purifican. El último paso es la generación de ADNc mediante transcripción inversa.
Secuenciación directa de ARN
Debido a que se ha demostrado que la conversión de ARN en ADNc , la ligadura, la amplificación y otras manipulaciones de muestras introducen sesgos y artefactos que pueden interferir tanto con la caracterización como con la cuantificación adecuadas de las transcripciones, [20] empresas como Helicos han explorado la secuenciación directa de ARN de una sola molécula. (en quiebra), Oxford Nanopore Technologies , [21] y otros. Esta tecnología secuencia moléculas de ARN directamente de manera masivamente paralela.
Secuenciación de ARN de una sola molécula en tiempo real
Se ha explorado el RNA-Seq directo de molécula única masivamente paralelo como una alternativa al RNA-Seq tradicional, en el que la conversión, ligación, amplificación y otros pasos de manipulación de muestras de ARN a ADNc pueden introducir sesgos y artefactos. [22] Las plataformas tecnológicas que realizan RNA-Seq en tiempo real de una sola molécula incluyen la secuenciación de nanoporos de Oxford Nanopore Technologies (ONT) , [21] PacBio IsoSeq y Helicos (en quiebra). La secuenciación del ARN en su forma nativa preserva modificaciones como la metilación, lo que permite investigarlas directa y simultáneamente. [21] Otro beneficio de RNA-Seq de una sola molécula es que las transcripciones se pueden cubrir en su totalidad, lo que permite una detección y cuantificación de isoformas de mayor confianza en comparación con la secuenciación de lectura corta. Tradicionalmente, los métodos RNA-Seq de una sola molécula tienen tasas de error más altas en comparación con la secuenciación de lectura corta, pero los métodos más nuevos como ONT direct RNA-Seq limitan los errores al evitar la fragmentación y la conversión de ADNc. Los usos recientes de ONT direct RNA-Seq para la expresión diferencial en poblaciones de células humanas han demostrado que esta tecnología puede superar muchas limitaciones de la secuenciación de ADNc corta y larga. [23]
Secuenciación de ARN unicelular (scRNA-Seq)
Los métodos estándar, como los microarrays y el análisis RNA-Seq en masa estándar, analizan la expresión de ARN de grandes poblaciones de células. En poblaciones de células mixtas, estas mediciones pueden ocultar diferencias críticas entre células individuales dentro de estas poblaciones. [24] [25]
Los protocolos actuales de scRNA-Seq implican los siguientes pasos: aislamiento de células individuales y ARN, transcripción inversa (RT), amplificación, generación de bibliotecas y secuenciación. Las células individuales se separan mecánicamente en micropocillos (p. ej., BD Rhapsody, Takara ICELL8, Vycap Puncher Platform o CellMicrosystems CellRaft) o se encapsulan en gotitas (p. ej., 10x Genomics Chromium, Illumina Bio-Rad ddSEQ, 1CellBio InDrop, Dolomite Bio Nadia). [28] Las células individuales se marcan añadiendo perlas con oligonucleótidos con código de barras; Tanto las células como las perlas se suministran en cantidades limitadas, de modo que la coocupación con múltiples células y perlas es un evento muy raro. Una vez que se completa la transcripción inversa, los ADNc de muchas células se pueden mezclar para secuenciarlos; Las transcripciones de una celda en particular se identifican mediante el código de barras único de cada celda. [29] [30] Se pueden adjuntar identificadores moleculares únicos (UMI) a secuencias objetivo de ARNm/ADNc para ayudar a identificar artefactos durante la preparación de la biblioteca. [31]
Los desafíos para scRNA-Seq incluyen preservar la abundancia relativa inicial de ARNm en una célula e identificar transcripciones raras. [32] El paso de transcripción inversa es fundamental ya que la eficiencia de la reacción de RT determina qué parte de la población de ARN de la célula será finalmente analizada por el secuenciador. La procesividad de las transcriptasas inversas y las estrategias de cebado utilizadas pueden afectar la producción de ADNc de longitud completa y la generación de bibliotecas sesgadas hacia el extremo 3' o 5' de los genes.
En el paso de amplificación, actualmente se utiliza PCR o transcripción in vitro (IVT) para amplificar el ADNc. Una de las ventajas de los métodos basados en PCR es la capacidad de generar ADNc de longitud completa. Sin embargo, la diferente eficiencia de la PCR en secuencias particulares (por ejemplo, contenido de GC y estructura snapback) también puede amplificarse exponencialmente, produciendo bibliotecas con cobertura desigual. Por otro lado, si bien las bibliotecas generadas por IVT pueden evitar el sesgo de secuencia inducido por la PCR, secuencias específicas pueden transcribirse de manera ineficiente, lo que provoca la pérdida de secuencias o la generación de secuencias incompletas. [33] [24]
Se han publicado varios protocolos scRNA-Seq: Tang et al., [34]
STRT, [35]
SMART-seq, [36]
CEL-seq, [37]
RAGE-seq, [38] Quartz -seq [39] y C1-CAGE. [40] Estos protocolos difieren en términos de estrategias para la transcripción inversa, síntesis y amplificación de ADNc, y la posibilidad de acomodar códigos de barras de secuencia específica (es decir, UMI ) o la capacidad de procesar muestras agrupadas. [41]
En 2017, se introdujeron dos enfoques para medir simultáneamente la expresión de proteínas y ARNm de una sola célula a través de anticuerpos marcados con oligonucleótidos conocidos como REAP-seq, [42] y CITE-seq. [43]
scRNA-Seq ha proporcionado información considerable sobre el desarrollo de embriones y organismos, incluido el gusano Caenorhabditis elegans , [50] y la planaria regenerativa Schmidtea mediterranea . [51] [52] Los primeros animales vertebrados en ser mapeados de esta manera fueron el pez cebra [53] [54] y Xenopus laevis . [55] En cada caso se estudiaron múltiples etapas del embrión, lo que permitió mapear todo el proceso de desarrollo célula por célula. [10] La ciencia reconoció estos avances como el Avance del Año 2018 . [56]
Especificidad del tejido: la expresión genética varía dentro y entre los tejidos, y RNA-Seq mide esta combinación de tipos de células. Esto puede dificultar el aislamiento del mecanismo biológico de interés. La secuenciación unicelular se puede utilizar para estudiar cada célula individualmente, mitigando este problema.
Dependencia del tiempo: la expresión genética cambia con el tiempo y RNA-Seq solo toma una instantánea. Se pueden realizar experimentos en el transcurso del tiempo para observar cambios en el transcriptoma.
Cobertura (también conocida como profundidad): el ARN alberga las mismas mutaciones observadas en el ADN y la detección requiere una cobertura más profunda. Con una cobertura suficientemente alta, RNA-Seq se puede utilizar para estimar la expresión de cada alelo. Esto puede proporcionar información sobre fenómenos como la impronta o los efectos reguladores en cis . La profundidad de la secuenciación requerida para aplicaciones específicas se puede extrapolar a partir de un experimento piloto. [57]
Artefactos de generación de datos (también conocidos como variación técnica): los reactivos (p. ej., kit de preparación de biblioteca), el personal involucrado y el tipo de secuenciador (p. ej., Illumina , Pacific Biosciences ) pueden generar artefactos técnicos que podrían malinterpretarse como resultados significativos. . Como ocurre con cualquier experimento científico, es prudente realizar RNA-Seq en un entorno bien controlado. Si esto no es posible o el estudio es un metanálisis , otra solución es detectar artefactos técnicos infiriendo variables latentes (normalmente análisis de componentes principales o análisis factorial ) y posteriormente corrigiendo estas variables. [58]
Gestión de datos: un único experimento de RNA-Seq en humanos suele tener entre 1 y 5 Gb (comprimido), o más si se incluyen archivos intermedios. [59] Este gran volumen de datos puede plantear problemas de almacenamiento. Una solución es comprimir los datos utilizando esquemas computacionales multipropósito (por ejemplo, gzip ) o esquemas específicos de genómica. Estas últimas pueden basarse en secuencias de referencia o de novo. Otra solución es realizar experimentos con microarrays, que pueden ser suficientes para trabajos basados en hipótesis o estudios de replicación (a diferencia de la investigación exploratoria).
Análisis
Montaje del transcriptoma
Se utilizan dos métodos para asignar lecturas de secuencias sin procesar a características genómicas (es decir, ensamblar el transcriptoma):
De novo: este enfoque no requiere un genoma de referencia para reconstruir el transcriptoma y generalmente se usa si el genoma es desconocido, está incompleto o está sustancialmente alterado en comparación con la referencia. [60] Los desafíos al usar lecturas cortas para el ensamblaje de novo incluyen 1) determinar qué lecturas deben unirse en secuencias contiguas ( contigs ), 2) robustez ante errores de secuenciación y otros artefactos, y 3) eficiencia computacional. El algoritmo principal utilizado para el ensamblaje de novo pasó de gráficos de superposición, que identifican todas las superposiciones por pares entre lecturas, a gráficos de De Bruijn , que dividen las lecturas en secuencias de longitud k y colapsan todos los k-meros en una tabla hash. [61] Se utilizaron gráficos de superposición con la secuenciación de Sanger, pero no se adaptan bien a los millones de lecturas generadas con RNA-Seq. Ejemplos de ensambladores que utilizan gráficos de De Bruijn son Trinity, [60] Oasis [62] (derivado del ensamblador del genoma Velvet [63] ), Bridger, [64] y rnaSPAdes. [65] La secuenciación de lectura larga y de extremos emparejados de la misma muestra puede mitigar los déficits en la secuenciación de lectura corta al servir como plantilla o esqueleto. Las métricas para evaluar la calidad de un ensamblaje de novo incluyen la longitud media de los contigs, el número de contigs y N50 . [66]
Guiado por el genoma: este enfoque se basa en los mismos métodos utilizados para la alineación del ADN, con la complejidad adicional de alinear lecturas que cubren porciones no continuas del genoma de referencia. [67] Estas lecturas no continuas son el resultado de la secuenciación de transcripciones empalmadas (ver figura). Normalmente, los algoritmos de alineación tienen dos pasos: 1) alinear porciones cortas de la lectura (es decir, sembrar el genoma) y 2) utilizar programación dinámica para encontrar una alineación óptima, a veces en combinación con anotaciones conocidas. Las herramientas de software que utilizan la alineación guiada por el genoma incluyen Bowtie , [68] TopHat (que se basa en los resultados de BowTie para alinear las uniones de empalme), [69] [70] Subread, [71] STAR, [67] HISAT2, [72] y GMAP. . [73] El resultado de las herramientas de alineación (mapeo) guiadas por el genoma se puede utilizar además mediante herramientas como Cufflinks [70] o StringTie [74] para reconstruir secuencias de transcripción contiguas ( es decir , un archivo FASTA). La calidad de un ensamblaje guiado por genoma se puede medir con 1) métricas de ensamblaje de novo (p. ej., N50) y 2) comparaciones con secuencias conocidas de transcripción, unión de empalme, genoma y proteínas utilizando precisión, recuperación o su combinación (p. ej., Puntuación F1). [66] Además, la evaluación in silico podría realizarse mediante lecturas simuladas. [75] [76]
Una nota sobre la calidad del ensamblaje: el consenso actual es que 1) la calidad del ensamblaje puede variar según la métrica que se utilice, 2) las herramientas de ensamblaje que obtuvieron buenos resultados en una especie no necesariamente funcionan bien en la otra especie, y 3) combinar diferentes enfoques podría ser el más confiable. [77] [78] [79]
Cuantificación de la expresión genética.
La expresión se cuantifica para estudiar los cambios celulares en respuesta a estímulos externos, las diferencias entre estados sanos y enfermos y otras preguntas de investigación. Los niveles de transcripción se utilizan a menudo como un indicador de la abundancia de proteínas, pero a menudo no son equivalentes debido a eventos postranscripcionales como la interferencia del ARN y la descomposición mediada sin sentido . [80]
La expresión se cuantifica contando el número de lecturas asignadas a cada locus en el paso de ensamblaje del transcriptoma. La expresión se puede cuantificar para exones o genes utilizando contigs o anotaciones de transcripción de referencia. [10] Estos recuentos de lecturas de RNA-Seq observados se han validado sólidamente frente a tecnologías más antiguas, incluidas las micromatrices de expresión y qPCR . [57] [81] Las herramientas que cuantifican los recuentos son HTSeq, [82] FeatureCounts, [83] Rcount, [84] maxcounts, [85] FIXSEQ, [86] y Cuffquant. Estas herramientas determinan los recuentos de lectura a partir de datos de RNA-Seq alineados, pero también se pueden obtener recuentos sin alineación con Sailfish [87] y Kallisto. [88] Los recuentos de lecturas se convierten luego en métricas apropiadas para pruebas de hipótesis, regresiones y otros análisis. Los parámetros para esta conversión son:
Profundidad/cobertura de secuenciación : aunque la profundidad se especifica previamente al realizar múltiples experimentos de RNA-Seq, aún variará ampliamente entre experimentos. [89] Por lo tanto, el número total de lecturas generadas en un solo experimento generalmente se normaliza convirtiendo los recuentos en fragmentos, lecturas o recuentos por millón de lecturas asignadas (FPM, RPM o CPM). La diferencia entre RPM y FPM se derivó históricamente durante la evolución de la secuenciación de fragmentos de un solo extremo a la secuenciación de extremos pares. En la secuenciación de un solo extremo, sólo hay una lectura por fragmento ( es decir , RPM = FPM). En la secuenciación de extremos pares, hay dos lecturas por fragmento ( es decir , RPM = 2 x FPM). La profundidad de secuenciación a veces se denomina tamaño de biblioteca , el número de moléculas de ADNc intermediarias en el experimento.
Longitud del gen: los genes más largos tendrán más fragmentos/lecturas/recuentos que los genes más cortos si la expresión de la transcripción es la misma. Esto se ajusta dividiendo el FPM por la longitud de una característica (que puede ser un gen, una transcripción o un exón), lo que da como resultado los fragmentos métricos por kilobase de característica por millón de lecturas mapeadas (FPKM). [90] Al observar grupos de características en muestras, FPKM se convierte en transcripciones por millón (TPM) dividiendo cada FPKM por la suma de FPKM dentro de una muestra. [91] [92] [93]
Salida total de ARN de la muestra: debido a que se extrae la misma cantidad de ARN de cada muestra, las muestras con más ARN total tendrán menos ARN por gen. Estos genes parecen tener una expresión disminuida, lo que genera falsos positivos en los análisis posteriores. [89] Las estrategias de normalización que incluyen cuantiles, DESeq2, TMM y Median Ratio intentan explicar esta diferencia comparando un conjunto de genes expresados de manera no diferencial entre muestras y escalando en consecuencia. [94]
Varianza para la expresión de cada gen: se modela para tener en cuenta el error de muestreo (importante para genes con recuentos de lectura bajos), aumentar la potencia y disminuir los falsos positivos. La varianza se puede estimar como unadistribución binomial normal , de Poisson o negativa [95] [96] [97] y con frecuencia se descompone en varianza técnica y biológica.
Spike-ins para la cuantificación absoluta y la detección de efectos en todo el genoma
Los picos de ARN son muestras de ARN en concentraciones conocidas que pueden usarse como estándares de oro en el diseño experimental y durante los análisis posteriores para la cuantificación absoluta y la detección de efectos en todo el genoma.
Cuantificación absoluta: la cuantificación absoluta de la expresión génica no es posible con la mayoría de los experimentos de RNA-Seq, que cuantifican la expresión en relación con todas las transcripciones. Es posible realizando RNA-Seq con picos, muestras de ARN en concentraciones conocidas. Después de la secuenciación, se utilizan recuentos de lectura de secuencias de inserción para determinar la relación entre los recuentos de lectura de cada gen y las cantidades absolutas de fragmentos biológicos. [13] [98] En un ejemplo, esta técnica se utilizó en embriones de Xenopus tropicalis para determinar la cinética de transcripción. [99]
Detección de efectos en todo el genoma: los cambios en los reguladores globales, incluidos los remodeladores de la cromatina , los factores de transcripción (p. ej., MYC ), los complejos de acetiltransferasa y el posicionamiento de los nucleosomas, no son congruentes con las suposiciones de normalización y los controles de aumento pueden ofrecer una interpretación precisa. [100] [101]
expresión diferencial
El uso más simple pero a menudo más poderoso de RNA-Seq es encontrar diferencias en la expresión genética entre dos o más afecciones ( p . ej ., tratadas versus no tratadas); este proceso se llama expresión diferencial. Las salidas se denominan frecuentemente genes expresados diferencialmente (DEG) y estos genes pueden estar regulados hacia arriba o hacia abajo ( es decir , más alto o más bajo en la condición de interés). Hay muchas herramientas que realizan expresión diferencial . La mayoría se ejecutan en R , Python o la línea de comandos de Unix . Las herramientas comúnmente utilizadas incluyen DESeq, [96] edgeR, [97] y voom+limma, [95] [102], todas las cuales están disponibles a través de R/ Bioconductor . [103] [104] Estas son las consideraciones comunes al realizar la expresión diferencial:
Entradas: las entradas de expresión diferencial incluyen (1) una matriz de expresión RNA-Seq (M genes x N muestras) y (2) una matriz de diseño que contiene condiciones experimentales para N muestras. La matriz de diseño más simple contiene una columna, correspondiente a las etiquetas de la condición que se está probando. Otras covariables (también denominadas factores, características, etiquetas o parámetros) pueden incluir efectos por lotes , artefactos conocidos y cualquier metadato que pueda confundir o mediar en la expresión genética. Además de las covariables conocidas, también se pueden estimar covariables desconocidas mediante enfoques de aprendizaje automático no supervisados que incluyen análisis de componente principal , variable sustituta [105] y PEER [58] . Los análisis de variables ocultas a menudo se emplean para datos de RNA-Seq de tejido humano, que generalmente tienen artefactos adicionales que no se capturan en los metadatos ( p . ej ., tiempo de isquemia, abastecimiento de múltiples instituciones, rasgos clínicos subyacentes, recopilación de datos a lo largo de muchos años con mucho personal).
Métodos: la mayoría de las herramientas utilizan regresión o estadísticas no paramétricas para identificar genes expresados diferencialmente y se basan en recuentos de lectura asignados a un genoma de referencia (DESeq2, limma, edgeR) o en recuentos de lectura derivados de una cuantificación sin alineación (sleuth, [106] Puños, [107] Vestido de fiesta [108] ). [109] Después de la regresión, la mayoría de las herramientas emplean ajustes de valor p de tasa de error familiar (FWER) o tasa de descubrimiento falso (FDR) para tener en cuenta múltiples hipótesis (en estudios en humanos, ~20 000 genes codificadores de proteínas o ~50 000 biotipos).
Salidas: una salida típica consta de filas correspondientes al número de genes y al menos tres columnas, el cambio logarítmico de cada gen ( transformación logarítmica de la relación de expresión entre condiciones, una medida del tamaño del efecto ), valor p y p. -valor ajustado para comparaciones múltiples . Los genes se definen como biológicamente significativos si pasan los límites de tamaño del efecto (cambio logarítmico) y significación estadística . Lo ideal es que estos límites se especifiquen a priori , pero la naturaleza de los experimentos de RNA-Seq suele ser exploratoria, por lo que es difícil predecir los tamaños de los efectos y los límites pertinentes con anticipación.
Errores: La razón de ser de estos métodos complejos es evitar la multitud de errores que pueden conducir a errores estadísticos e interpretaciones engañosas. Los obstáculos incluyen mayores tasas de falsos positivos (debido a comparaciones múltiples), artefactos en la preparación de muestras, heterogeneidad de las muestras (como antecedentes genéticos mixtos), muestras altamente correlacionadas, diseños experimentales de múltiples niveles no contabilizados y un diseño experimental deficiente . Un problema notable es ver los resultados en Microsoft Excel sin utilizar la función de importación para garantizar que los nombres de los genes sigan siendo texto. [110] Aunque es conveniente, Excel convierte automáticamente algunos nombres de genes ( 1 DE SEPTIEMBRE , 1 DE DICIEMBRE , 2 DE MARZO ) en fechas o números de punto flotante.
Elección de herramientas y evaluación comparativa: existen numerosos esfuerzos que comparan los resultados de estas herramientas, y DESeq2 tiende a superar moderadamente a otros métodos. [111] [112] [113] [114] [19] [109] [115] [116] Al igual que con otros métodos, la evaluación comparativa consiste en comparar los resultados de las herramientas entre sí y con los estándares de oro conocidos .
Los análisis posteriores para obtener una lista de genes expresados diferencialmente son de dos tipos: validan observaciones y hacen inferencias biológicas. Debido a los inconvenientes de la expresión diferencial y RNA-Seq, las observaciones importantes se replican con (1) un método ortogonal en las mismas muestras (como la PCR en tiempo real ) o (2) otro experimento, a veces prerregistrado , en una nueva cohorte. . Esto último ayuda a garantizar la generalización y, por lo general, puede seguirse con un metanálisis de todas las cohortes agrupadas. El método más común para obtener una comprensión biológica de alto nivel de los resultados es el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes , aunque a veces se emplean enfoques de genes candidatos. El enriquecimiento del conjunto de genes determina si la superposición entre dos conjuntos de genes es estadísticamente significativa, en este caso la superposición entre genes expresados diferencialmente y conjuntos de genes de vías/bases de datos conocidas (p. ej., ontología de genes , KEGG , ontología de fenotipo humano ) o de análisis complementarios en el mismos datos (como redes de coexpresión). Las herramientas comunes para el enriquecimiento de conjuntos de genes incluyen interfaces web ( p. ej. , ENRICHR, g:profiler, WEBGESTALT) [117] y paquetes de software. Al evaluar los resultados del enriquecimiento, una heurística es buscar primero el enriquecimiento de la biología conocida como control de cordura y luego ampliar el alcance para buscar biología novedosa.
Splicing alternativo
El empalme de ARN es integral para los eucariotas y contribuye significativamente a la regulación y diversidad de proteínas, y ocurre en >90% de los genes humanos. [118] Existen múltiples modos de empalme alternativos : omisión de exones (modo de empalme más común en humanos y eucariotas superiores), exones mutuamente excluyentes, sitios donantes o aceptores alternativos, retención de intrones (modo de empalme más común en plantas, hongos y protozoos), sitio de inicio de transcripción alternativo (promotor) y poliadenilación alternativa. [118] Un objetivo de RNA-Seq es identificar eventos de empalme alternativos y probar si difieren entre condiciones. La secuenciación de lectura larga captura la transcripción completa y, por lo tanto, minimiza muchos de los problemas al estimar la abundancia de isoformas, como el mapeo de lectura ambiguo. Para RNA-Seq de lectura corta, existen múltiples métodos para detectar empalmes alternativos que se pueden clasificar en tres grupos principales: [119] [91] [120]
Empalme diferencial basado en recuentos (también basado en eventos): estimación de la retención de exones. Algunos ejemplos son DEXSeq, [121] MATS, [122] y SeqGSEA. [123]
Basado en isoformas (también módulos de lectura múltiple, expresión diferencial de isoformas) : estime primero la abundancia de isoformas y luego la abundancia relativa entre condiciones. Algunos ejemplos son Cufflinks 2 [124] y DiffSplice. [125]
Basado en escisión de intrones: calcule el empalme alternativo mediante lecturas divididas. Algunos ejemplos son MAJIQ [126] y Leafcutter. [120]
Las herramientas de expresión genética diferencial también se pueden utilizar para la expresión de isoformas diferenciales si las isoformas se cuantifican de antemano con otras herramientas como RSEM. [127]
Redes de coexpresión
Las redes de coexpresión son representaciones derivadas de datos de genes que se comportan de manera similar en tejidos y condiciones experimentales. [128] Su objetivo principal radica en la generación de hipótesis y los enfoques de culpa por asociación para inferir funciones de genes previamente desconocidos. [128] Los datos de RNA-Seq se han utilizado para inferir genes involucrados en vías específicas basadas en la correlación de Pearson , tanto en plantas [129] como en mamíferos. [130] La principal ventaja de los datos de RNA-Seq en este tipo de análisis sobre las plataformas de microarrays es la capacidad de cubrir todo el transcriptoma, lo que permite desentrañar representaciones más completas de las redes reguladoras de genes. La regulación diferencial de las isoformas de empalme del mismo gen se puede detectar y utilizar para predecir sus funciones biológicas. [131] [132] El análisis de redes de coexpresión de genes ponderados se ha utilizado con éxito para identificar módulos de coexpresión y genes centrales intramodulares basados en datos de secuencias de ARN. Los módulos de coexpresión pueden corresponder a tipos o vías de células. Los hubs intramodulares altamente conectados pueden interpretarse como representantes de su módulo respectivo. Un gen propio es una suma ponderada de expresión de todos los genes en un módulo. Los genes propios son biomarcadores (características) útiles para el diagnóstico y el pronóstico. [133] Se han propuesto enfoques de transformación estabilizadora de la varianza para estimar coeficientes de correlación basados en datos de secuencias de ARN. [129]
Descubrimiento de variantes
RNA-Seq captura la variación del ADN, incluidas variantes de un solo nucleótido y pequeñas inserciones/eliminaciones . y variación estructural . La llamada de variantes en RNA-Seq es similar a la llamada de variantes de ADN y, a menudo, emplea las mismas herramientas (incluidas SAMtools mpileup [134] y GATK HaplotypeCaller [135] ) con ajustes para tener en cuenta el empalme. Una dimensión única para las variantes de ARN es la expresión específica de alelo (ASE) : las variantes de un solo haplotipo podrían expresarse preferentemente debido a efectos reguladores que incluyen la impresión y la expresión de loci de rasgos cuantitativos y variantes raras no codificantes . [136] [137] Las limitaciones de la identificación de variantes de ARN incluyen que solo refleja regiones expresadas (en humanos, <5% del genoma), podría estar sujeta a sesgos introducidos por el procesamiento de datos (p. ej., los conjuntos de transcriptomas de novo subestiman la heterocigosidad [138 ] ), y tiene una calidad inferior en comparación con la secuenciación directa de ADN.
Edición de ARN (alteraciones postranscripcionales)
Tener las secuencias genómicas y transcriptómicas coincidentes de un individuo puede ayudar a detectar ediciones postranscripcionales ( edición de ARN ). [3] Se identifica un evento de modificación postranscripcional si la transcripción del gen tiene un alelo/variante no observado en los datos genómicos.
Detección de genes de fusión
Provocados por diferentes modificaciones estructurales en el genoma, los genes de fusión han ganado atención por su relación con el cáncer. [139] La capacidad de RNA-Seq para analizar el transcriptoma completo de una muestra de manera imparcial lo convierte en una herramienta atractiva para encontrar este tipo de eventos comunes en el cáncer. [4]
La idea surge del proceso de alinear las lecturas transcriptómicas cortas con un genoma de referencia. La mayoría de las lecturas cortas se ubicarán dentro de un exón completo, y se esperaría que un conjunto más pequeño pero aún grande se mapee en uniones exón-exón conocidas. Las lecturas cortas restantes no asignadas se analizarían más a fondo para determinar si coinciden con una unión exón-exón donde los exones provienen de genes diferentes. Esto sería evidencia de un posible evento de fusión; sin embargo, debido a la longitud de las lecturas, esto podría resultar muy ruidoso. Un enfoque alternativo es utilizar lecturas de extremos emparejados, cuando una cantidad potencialmente grande de lecturas emparejadas asignaría cada extremo a un exón diferente, brindando una mejor cobertura de estos eventos (ver figura). No obstante, el resultado final consta de combinaciones de genes múltiples y potencialmente novedosas que proporcionan un punto de partida ideal para una mayor validación.
Alteración del número de copia
Los análisis de alteración del número de copias (CNA) se utilizan comúnmente en estudios de cáncer. La ganancia y la pérdida de genes tienen implicaciones en las vías de señalización y son un biomarcador clave de disfunción molecular en oncología. Obtener la información de CNA a partir de datos de RNA-Seq no es sencillo debido a las diferencias en la expresión genética, que conducen a una variación de la profundidad de lectura de diferentes magnitudes entre los genes. Debido a estas dificultades, la mayoría de estos análisis generalmente se realizan mediante secuenciación del genoma completo/secuenciación del exoma completo (WGS/WES). Pero las herramientas bioinformáticas avanzadas pueden llamar a CNA desde RNA-Seq. [140]
Otros análisis y aplicaciones emergentes
Las aplicaciones de RNA-Seq crecen día a día. Otra aplicación nueva de RNA-Seq incluye la detección de contaminantes microbianos, [141] determinar la abundancia del tipo de célula (deconvolución del tipo de célula), [8] medir la expresión de TE y la predicción de neoantígenos, etc. [8]
Historia
RNA-Seq se desarrolló por primera vez a mediados de la década de 2000 con la llegada de la tecnología de secuenciación de próxima generación. [144] Los primeros manuscritos que utilizaron RNA-Seq incluso sin utilizar el término incluyen los de líneas celulares de cáncer de próstata [145] (con fecha de 2006), Medicago truncatula [146] (2006), maíz [147] (2007) y Arabidopsis. thaliana [148] (2007), mientras que el término "RNA-Seq" en sí se mencionó por primera vez en 2008. [13] [149] El número de manuscritos que hacen referencia a RNA-Seq en el título o resumen (Figura, línea azul) es aumentando continuamente con 6754 manuscritos publicados en 2018. La intersección de RNA-Seq y la medicina (Figura, línea dorada) tiene una celeridad similar. [150]
Aplicaciones a la medicina
RNA-Seq tiene el potencial de identificar la biología de nuevas enfermedades, perfilar biomarcadores para indicaciones clínicas, inferir vías farmacológicas y realizar diagnósticos genéticos. Estos resultados podrían personalizarse aún más para subgrupos o incluso pacientes individuales, lo que podría resaltar una prevención, diagnóstico y terapia más eficaces. La viabilidad de este enfoque depende en parte de los costos en dinero y tiempo; una limitación relacionada es el equipo necesario de especialistas (bioinformáticos, médicos/clínicos, investigadores básicos, técnicos) para interpretar completamente la enorme cantidad de datos generados por este análisis. [151]
Esfuerzos de secuenciación a gran escala.
Se ha dado mucho énfasis a los datos de RNA-Seq después de que los proyectos Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) y The Cancer Genome Atlas (TCGA) utilizaron este enfoque para caracterizar docenas de líneas celulares [152] y miles de muestras de tumores primarios. [153] respectivamente. ENCODE tenía como objetivo identificar regiones reguladoras de todo el genoma en diferentes cohortes de líneas celulares y los datos transcriptómicos son fundamentales para comprender el efecto posterior de esas capas reguladoras genéticas y epigenéticas. TCGA, en cambio, tenía como objetivo recopilar y analizar miles de muestras de pacientes de 30 tipos de tumores diferentes para comprender los mecanismos subyacentes de la transformación y progresión maligna. En este contexto, los datos de RNA-Seq proporcionan una instantánea única del estado transcriptómico de la enfermedad y analizan una población imparcial de transcripciones que permite la identificación de transcripciones nuevas, transcripciones de fusión y ARN no codificantes que podrían no detectarse con diferentes tecnologías.
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Otras lecturas
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enlaces externos
Scholia tiene un perfil de tema para RNA-Seq .
Cresko B, Voelker R, Pequeño C (2001). Bassham S, Catchen J (eds.). "ARN-seqlopedia". Universidad de Oregon.: una guía de alto nivel para diseñar e implementar un experimento de RNA-Seq.