La inmunoprecipitación ( IP ) es la técnica de precipitación de un antígeno proteico de una solución utilizando un anticuerpo que se une específicamente a esa proteína en particular. Este proceso se puede utilizar para aislar y concentrar una proteína en particular de una muestra que contiene miles de proteínas diferentes. La inmunoprecipitación requiere que el anticuerpo se acople a un sustrato sólido en algún punto del procedimiento.
Implica el uso de un anticuerpo específico para una proteína conocida con el fin de aislar esa proteína en particular de una solución que contiene muchas proteínas diferentes. Estas soluciones suelen presentarse en forma de lisado crudo de tejido vegetal o animal. Otros tipos de muestras pueden ser fluidos corporales u otras muestras de origen biológico.
La inmunoprecipitación de complejos proteicos intactos (es decir, antígeno junto con cualquier proteína o ligando que esté unido a él) se conoce como co-inmunoprecipitación (Co-IP). La co-IP funciona seleccionando un anticuerpo que se dirige a una proteína conocida que se cree que es miembro de un complejo más grande de proteínas. Al dirigirse a este miembro conocido con un anticuerpo, puede resultar posible extraer todo el complejo proteico de la solución y, de ese modo, identificar miembros desconocidos del complejo.
Esto funciona cuando las proteínas involucradas en el complejo se unen entre sí con fuerza, lo que hace posible extraer múltiples miembros del complejo de la solución al unirse a uno de ellos con un anticuerpo. Este concepto de extraer complejos proteicos de la solución a veces se denomina "pull-down". La co-IP es una técnica poderosa que los biólogos moleculares utilizan regularmente para analizar las interacciones proteína-proteína .
La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método que se utiliza para determinar la ubicación de los sitios de unión del ADN en el genoma para una proteína de interés en particular. Esta técnica proporciona una imagen de las interacciones proteína-ADN que ocurren dentro del núcleo de las células o tejidos vivos. La naturaleza in vivo de este método contrasta con otros enfoques tradicionalmente empleados para responder las mismas preguntas.
El principio que sustenta este ensayo es que las proteínas de unión al ADN (incluidos los factores de transcripción y las histonas ) en células vivas pueden reticularse con el ADN al que se unen. Al utilizar un anticuerpo específico para una supuesta proteína de unión al ADN, se puede inmunoprecipitar el complejo proteína-ADN a partir de lisados celulares. La reticulación a menudo se logra aplicando formaldehído a las células (o tejido), aunque a veces es ventajoso utilizar un reticulante más definido y consistente como dimetil 3,3'-ditiobispropionimidato-2 HCl (DTBP). [1] Después de la reticulación, las células se lisan y el ADN se rompe en pedazos de 0,2 a 1,0 kb de longitud mediante sonicación . En este punto, se realiza la inmunoprecipitación que da como resultado la purificación de los complejos proteína-ADN. Luego, los complejos proteína-ADN purificados se calientan para revertir la reticulación con formaldehído de los complejos proteína y ADN, lo que permite separar el ADN de las proteínas. La identidad y cantidad de los fragmentos de ADN aislados se pueden determinar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La limitación de realizar la PCR en los fragmentos aislados es que uno debe tener una idea de qué región genómica se está buscando para generar los cebadores de PCR correctos. A veces, esta limitación se evita simplemente clonando el ADN genómico aislado en un vector plasmídico y luego utilizando cebadores que son específicos para la región de clonación de ese vector. Alternativamente, cuando uno quiere encontrar dónde se une la proteína a escala de todo el genoma, se utiliza la secuenciación ChIP y recientemente ha surgido como una tecnología estándar que puede localizar los sitios de unión de proteínas de una manera rentable y de alto rendimiento, lo que también permite la caracterización del cistroma . Anteriormente, también se utilizaba la micromatriz de ADN ( ChIP-on-chip o ChIP-chip ).
Tanto RIP como CLIP purifican una proteína de unión a ARN específica para identificar ARN unidos, estudiando así las ribonucleoproteínas (RNP). [2] [3] En RIP , se extraen los ARN copurificados y se compara su enriquecimiento con el control, que originalmente se hizo mediante microarray o RT-PCR . En CLIP , las células se reticulan con UV antes de la lisis, seguido de pasos de purificación adicionales más allá de la inmunoprecipitación estándar, que incluyen fragmentación parcial de ARN, lavado con alto contenido de sal, separación por SDS-PAGE y transferencia de membrana, e identificación de sitios de unión directa de ARN mediante secuenciación de ADNc .
Uno de los principales obstáculos técnicos de la inmunoprecipitación es la gran dificultad de generar un anticuerpo que se dirija específicamente a una única proteína conocida. Para superar este obstáculo, muchos grupos diseñarán etiquetas en el extremo C o N de la proteína de interés. La ventaja aquí es que la misma etiqueta se puede utilizar una y otra vez en muchas proteínas diferentes y el investigador puede utilizar el mismo anticuerpo cada vez. Las ventajas de utilizar proteínas etiquetadas son tan grandes que esta técnica se ha vuelto común para todos los tipos de inmunoprecipitación, incluidos todos los tipos de IP detallados anteriormente. Algunos ejemplos de etiquetas en uso son la etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), la etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST) y la etiqueta FLAG-tag . Si bien el uso de una etiqueta para permitir pull-downs es conveniente, plantea algunas preocupaciones con respecto a la relevancia biológica porque la etiqueta en sí puede ocultar interacciones nativas o introducir interacciones nuevas y no naturales.
Los dos métodos generales para la inmunoprecipitación son el método de captura directa y el método de captura indirecta.
Los anticuerpos específicos para una proteína en particular (o un grupo de proteínas) se inmovilizan en un sustrato en fase sólida, como microesferas superparamagnéticas o microesferas de agarosa (no magnéticas). Las microesferas con anticuerpos unidos se añaden a la mezcla de proteínas y las proteínas a las que se dirigen los anticuerpos quedan capturadas en las microesferas a través de los anticuerpos; en otras palabras, se inmunoprecipitan.
Los anticuerpos específicos para una proteína en particular, o un grupo de proteínas, se añaden directamente a la mezcla de proteínas. Los anticuerpos aún no se han unido a un soporte de fase sólida. Los anticuerpos flotan libremente en la mezcla de proteínas y se unen a sus objetivos. A medida que pasa el tiempo, se añaden perlas recubiertas de proteína A/G a la mezcla de anticuerpo y proteína. En este punto, los anticuerpos, que ahora están unidos a sus objetivos, se pegarán a las perlas.
A partir de este punto, los protocolos directo e indirecto convergen porque las muestras tienen ahora los mismos ingredientes. Ambos métodos dan el mismo resultado final con la proteína o los complejos proteicos unidos a los anticuerpos que a su vez están inmovilizados en las microesferas.
En ocasiones, se prefiere un enfoque indirecto cuando la concentración de la proteína diana es baja o cuando la afinidad específica del anticuerpo por la proteína es débil. El método indirecto también se utiliza cuando la cinética de unión del anticuerpo a la proteína es lenta por diversas razones. En la mayoría de las situaciones, el método directo es la opción predeterminada y preferida.
Históricamente, el soporte de fase sólida para la inmunoprecipitación utilizado por la mayoría de los científicos han sido perlas de agarosa altamente porosas (también conocidas como resinas o lodos de agarosa). La ventaja de esta tecnología es una capacidad de unión potencial muy alta, ya que prácticamente toda la estructura esponjosa de la partícula de agarosa (de 50 a 150 μm de tamaño) está disponible para la unión de anticuerpos (que a su vez se unirán a las proteínas objetivo) y el uso de equipo de laboratorio estándar para todos los aspectos del protocolo IP sin la necesidad de ningún equipo especializado. La ventaja de una capacidad de unión extremadamente alta debe equilibrarse cuidadosamente con la cantidad de anticuerpo que el investigador está dispuesto a utilizar para recubrir las perlas de agarosa. Debido a que los anticuerpos pueden ser un factor limitante de costos, es mejor calcular hacia atrás desde la cantidad de proteína que se necesita capturar (dependiendo del análisis que se realizará posteriormente), hasta la cantidad de anticuerpo que se requiere para unir esa cantidad de proteína (con un pequeño exceso agregado para tener en cuenta las ineficiencias del sistema), y aún más atrás hasta la cantidad de agarosa que se necesita para unir esa cantidad particular de anticuerpo. En los casos en que no se requiere la saturación de anticuerpos, esta tecnología no tiene rival en su capacidad para capturar cantidades extremadamente grandes de proteínas objetivo capturadas. La advertencia aquí es que la "ventaja de alta capacidad" puede convertirse en una "desventaja de alta capacidad" que se manifiesta cuando la enorme capacidad de unión de las perlas de sefarosa /agarosa no está completamente saturada con anticuerpos. A menudo sucede que la cantidad de anticuerpo disponible para el investigador para su experimento de inmunoprecipitación es menos que suficiente para saturar las perlas de agarosa que se utilizarán en la inmunoprecipitación. En estos casos, el investigador puede terminar con partículas de agarosa que solo están parcialmente recubiertas con anticuerpos, y la parte de la capacidad de unión de las perlas de agarosa que no está recubierta con anticuerpos queda libre para unirse a cualquier cosa que se adhiera, lo que da como resultado una señal de fondo elevada debido a la unión no específica de los componentes del lisado a las perlas, lo que puede dificultar la interpretación de los datos. Si bien algunos pueden argumentar que por estas razones es prudente hacer coincidir la cantidad de agarosa (en términos de capacidad de unión) con la cantidad de anticuerpo que se desea unir para la inmunoprecipitación, una forma sencilla de reducir el problema de la unión no específica a las perlas de agarosa y aumentar la especificidad es preaclarar el lisado, lo que para cualquier inmunoprecipitación es muy recomendable. [4] [5]
Los lisados son mezclas complejas de proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos, y se debe asumir que se producirá cierta cantidad de unión no específica al anticuerpo IP, la proteína A/G o el soporte en forma de perlas, lo que afectará negativamente la detección de los objetivos inmunoprecipitados. En la mayoría de los casos, la prelimpieza del lisado al comienzo de cada experimento de inmunoprecipitación (consulte el paso 2 en la sección "protocolo" a continuación) [6] es una forma de eliminar los componentes potencialmente reactivos del lisado celular antes de la inmunoprecipitación para evitar la unión no específica de estos componentes a las perlas IP o al anticuerpo. El procedimiento básico de prelimpieza se describe a continuación, en el que el lisado se incuba solo con perlas, que luego se eliminan y se descartan antes de la inmunoprecipitación. [6] Sin embargo, este enfoque no tiene en cuenta la unión no específica al anticuerpo IP, que puede ser considerable. Por lo tanto, un método alternativo de preaclaración es incubar la mezcla de proteínas con exactamente los mismos componentes que se utilizarán en la inmunoprecipitación, excepto que se utiliza un anticuerpo irrelevante no objetivo de la misma subclase de anticuerpo que el anticuerpo IP en lugar del propio anticuerpo IP. [5] Este enfoque intenta utilizar condiciones y componentes IP lo más parecidos a los de la inmunoprecipitación real para eliminar cualquier constituyente celular no específico sin capturar la proteína objetivo (a menos, por supuesto, que la proteína objetivo se una de forma no específica a algún otro componente IP, lo que debe controlarse adecuadamente analizando las perlas descartadas utilizadas para preaclarar el lisado). La proteína objetivo puede entonces inmunoprecipitarse con el riesgo reducido de que la unión no específica interfiera con la interpretación de los datos.
Si bien la gran mayoría de las inmunoprecipitaciones se realizan con perlas de agarosa, el uso de perlas superparamagnéticas para inmunoprecipitación es un enfoque más nuevo que está ganando popularidad como alternativa a las perlas de agarosa para aplicaciones de IP. A diferencia de la agarosa, las perlas magnéticas son sólidas y pueden ser esféricas, según el tipo de perla, y la unión de anticuerpos se limita a la superficie de cada perla. Si bien estas perlas no tienen la ventaja de un centro poroso para aumentar la capacidad de unión, las perlas magnéticas son significativamente más pequeñas que las perlas de agarosa (1 a 4 μm), y la mayor cantidad de perlas magnéticas por volumen que las perlas de agarosa en conjunto les da a las perlas magnéticas una relación área de superficie a volumen efectiva para una unión óptima de anticuerpos.
Las perlas magnéticas disponibles comercialmente se pueden separar en función de la uniformidad de tamaño en perlas monodispersas y polidispersas . Las perlas monodispersas, también llamadas microperlas , exhiben una uniformidad exacta y, por lo tanto, todas las perlas exhiben características físicas idénticas, incluida la capacidad de unión y el nivel de atracción a los imanes. Las perlas polidispersas, aunque similares en tamaño a las perlas monodispersas, muestran un amplio rango de variabilidad de tamaño (1 a 4 μm) que puede influir en su capacidad de unión y captura magnética. Aunque ambos tipos de perlas están disponibles comercialmente para aplicaciones de inmunoprecipitación, las perlas superparamagnéticas monodispersas de mayor calidad son más ideales para protocolos automáticos debido a su tamaño, forma y rendimiento consistentes. Muchas empresas ofrecen perlas superparamagnéticas monodispersas y polidispersas, incluidas Invitrogen , Thermo Scientific y Millipore .
Los defensores de las perlas magnéticas afirman que las perlas exhiben una tasa más rápida de unión de proteínas [7] [8] [9] que las perlas de agarosa para aplicaciones de inmunoprecipitación, aunque se han realizado inmunoprecipitaciones estándar basadas en perlas de agarosa en 1 hora. [5] También se han hecho afirmaciones de que las perlas magnéticas son mejores para inmunoprecipitar complejos proteicos extremadamente grandes debido a la completa falta de un límite de tamaño superior para tales complejos, [7] [8] [10] aunque no hay evidencia imparcial que afirme esta afirmación. La naturaleza de la tecnología de perlas magnéticas da como resultado una menor manipulación de la muestra [8] debido al menor estrés físico en las muestras de separación magnética versus centrifugación repetida cuando se usa agarosa, lo que puede contribuir en gran medida a aumentar el rendimiento de complejos proteicos lábiles (frágiles). [8] [9] [10] Sin embargo, factores adicionales, como la capacidad de unión, el costo del reactivo, el requisito de equipo adicional y la capacidad de automatizar los procesos de IP deben considerarse en la selección de un soporte de inmunoprecipitación.
Los defensores de las perlas de agarosa y las perlas magnéticas pueden discutir si la gran diferencia en las capacidades de unión de las dos perlas favorece a un tipo particular de perla. En una comparación perla a perla, las perlas de agarosa tienen un área de superficie significativamente mayor y, por lo tanto, una mayor capacidad de unión que las perlas magnéticas debido al gran tamaño de las perlas y la estructura similar a una esponja. Pero el tamaño variable de los poros de la agarosa causa un límite de tamaño superior potencial que puede afectar la unión de proteínas o complejos proteicos extremadamente grandes a los sitios de unión internos y, por lo tanto, las perlas magnéticas pueden ser más adecuadas para inmunoprecipitar proteínas o complejos proteicos grandes que las perlas de agarosa, aunque no hay evidencia comparativa independiente que demuestre cualquiera de los dos casos.
Algunos sostienen que la capacidad de unión significativamente mayor de las perlas de agarosa puede ser una desventaja debido a la mayor capacidad de unión no específica. Otros pueden argumentar a favor del uso de perlas magnéticas debido a la mayor cantidad de anticuerpos necesarios para saturar la capacidad de unión total de las perlas de agarosa, lo que obviamente sería una desventaja económica del uso de agarosa. Si bien estos argumentos son correctos fuera del contexto de su uso práctico, estas líneas de razonamiento ignoran dos aspectos clave del principio de inmunoprecipitación que demuestra que la decisión de usar agarosa o perlas magnéticas no está determinada simplemente por la capacidad de unión.
En primer lugar, la unión no específica no se limita a los sitios de unión del anticuerpo en el soporte inmovilizado; cualquier superficie del anticuerpo o componente de la reacción de inmunoprecipitación puede unirse a constituyentes no específicos del lisado y, por lo tanto, la unión no específica seguirá produciéndose incluso cuando se utilicen microesferas completamente saturadas. Por eso es importante preaclarar la muestra antes de realizar la inmunoprecipitación.
En segundo lugar, la capacidad de capturar la proteína objetivo depende directamente de la cantidad de anticuerpo inmovilizado utilizado y, por lo tanto, en una comparación en paralelo de la inmunoprecipitación con agarosa y perlas magnéticas, la mayor cantidad de proteína que puede capturar cada soporte está limitada por la cantidad de anticuerpo añadido. Por lo tanto, la decisión de saturar cualquier tipo de soporte depende de la cantidad de proteína necesaria, como se describe anteriormente en la sección Agarosa de esta página.
El precio de utilizar cualquiera de los dos tipos de soporte es un factor determinante en el uso de agarosa o perlas magnéticas para aplicaciones de inmunoprecipitación. Un cálculo a primera vista típico del costo de las perlas magnéticas en comparación con las perlas de sefarosa puede hacer que estas últimas parezcan menos costosas. Sin embargo, las perlas magnéticas pueden tener un precio competitivo en comparación con la agarosa para inmunoprecipitaciones a escala analítica, dependiendo del método IP utilizado y del volumen de perlas necesario por reacción IP.
Utilizando el método tradicional de inmunoprecipitación por lotes que se detalla a continuación, en el que todos los componentes se añaden a un tubo durante la reacción de IP, las características de manipulación física de las perlas de agarosa requieren una cantidad mínima de perlas para cada experimento de IP (normalmente en el rango de 25 a 50 μl de perlas por IP). Esto se debe a que las perlas de sefarosa deben concentrarse en el fondo del tubo mediante centrifugación y el sobrenadante debe eliminarse después de cada incubación, lavado, etc. Esto impone limitaciones físicas absolutas al proceso, ya que los pellets de perlas de agarosa de menos de 25 a 50 μl son difíciles, si no imposibles, de identificar visualmente en el fondo del tubo. Con las perlas magnéticas, no se requiere una cantidad mínima de perlas debido a la manipulación magnética y, por lo tanto, dependiendo del antígeno objetivo y del anticuerpo de IP, es posible utilizar considerablemente menos perlas magnéticas.
Por el contrario, se pueden emplear columnas de centrifugación en lugar de tubos de microcentrífuga normales para reducir significativamente la cantidad de perlas de agarosa necesarias por reacción. Las columnas de centrifugación contienen un filtro que permite que todos los componentes de IP, excepto las perlas, fluyan a través de ellas mediante una breve centrifugación y, por lo tanto, proporcionan un método para utilizar significativamente menos perlas de agarosa con una pérdida mínima.
Como se mencionó anteriormente, solo se requiere equipo de laboratorio estándar para el uso de perlas de agarosa en aplicaciones de inmunoprecipitación, mientras que se requieren imanes de alta potencia para las reacciones de IP basadas en perlas magnéticas. Si bien el equipo de captura magnética puede ser prohibitivo en términos de costo, la finalización rápida de inmunoprecipitaciones utilizando perlas magnéticas puede ser un enfoque económicamente beneficioso cuando se deben otorgar subvenciones, porque un protocolo de 30 minutos con perlas magnéticas en comparación con la incubación durante la noche a 4 °C con perlas de agarosa puede generar más datos en un período de tiempo más corto. [7] [8] [9]
Un beneficio adicional del uso de perlas magnéticas es que cada vez hay más dispositivos de inmunoprecipitación automatizados disponibles. Estos dispositivos no solo reducen la cantidad de trabajo y tiempo necesarios para realizar una IP, sino que también se pueden utilizar para aplicaciones de alto rendimiento .
Si bien los beneficios claros del uso de perlas magnéticas incluyen una mayor velocidad de reacción, un manejo más cuidadoso de las muestras y el potencial de automatización, la elección de usar agarosa o perlas magnéticas en función de la capacidad de unión del medio de soporte y el costo del producto puede depender de la proteína de interés y del método de IP utilizado. Como ocurre con todos los ensayos, se requieren pruebas empíricas para determinar qué método es óptimo para una aplicación determinada.
Una vez que se ha elegido la tecnología de microesferas de sustrato sólido, los anticuerpos se acoplan a las microesferas y las microesferas recubiertas de anticuerpos se pueden agregar a la muestra de proteína heterogénea (por ejemplo, tejido homogeneizado). En este punto, los anticuerpos que están inmovilizados en las microesferas se unirán a las proteínas que reconocen específicamente. Una vez que esto ha ocurrido, la parte de inmunoprecipitación del protocolo está realmente completa, ya que las proteínas específicas de interés se unen a los anticuerpos que están inmovilizados en las microesferas. La separación de los inmunocomplejos del lisado es una serie de pasos extremadamente importante, porque las proteínas deben permanecer unidas entre sí (en el caso de co-IP) y unidas al anticuerpo durante los pasos de lavado para eliminar las proteínas no unidas y reducir el fondo.
Cuando se trabaja con perlas de agarosa, estas deben separarse de la muestra mediante un breve centrifugado con fuerzas de entre 600 y 3000 xg (veces la fuerza gravitacional estándar). Este paso se puede realizar en un tubo de microcentrífuga estándar, pero para una separación más rápida, una mayor consistencia y mayores recuperaciones, el proceso se realiza a menudo en pequeñas columnas de centrifugado con un tamaño de poro que permite el paso del líquido, pero no de las perlas de agarosa. Después de la centrifugación, las perlas de agarosa formarán un pellet muy suelto y esponjoso en el fondo del tubo. El sobrenadante que contiene contaminantes se puede retirar con cuidado para no alterar las perlas. A continuación, se puede añadir el tampón de lavado a las perlas y, después de mezclarlas, se vuelven a separar por centrifugación.
En el caso de las perlas superparamagnéticas, la muestra se coloca en un campo magnético para que las perlas se acumulen en el lateral del tubo. Este procedimiento suele completarse en aproximadamente 30 segundos y el líquido restante (no deseado) se retira con una pipeta. Los lavados se realizan resuspendiendo las perlas (fuera del imán) con la solución de lavado y luego concentrándolas nuevamente en la pared del tubo (colocando el tubo nuevamente sobre el imán). El lavado generalmente se repite varias veces para garantizar la eliminación adecuada de contaminantes. Si las perlas superparamagnéticas son de tamaño homogéneo y el imán se ha diseñado correctamente, las perlas se concentrarán uniformemente en el lateral del tubo y la solución de lavado se puede eliminar fácil y completamente.
Después del lavado, las proteínas precipitadas se eluyen y se analizan mediante electroforesis en gel , espectrometría de masas , transferencia Western o cualquier otro método para identificar los componentes del complejo. Los tiempos del protocolo para la inmunoprecipitación varían en gran medida debido a una variedad de factores; los tiempos del protocolo aumentan con la cantidad de lavados necesarios o con la cinética de reacción más lenta de las perlas de agarosa porosas.
Técnicas técnicas de co-inmunoprecipitación (Co-IP)