La re-replicación del ADN (o simplemente re-replicación ) es un fenómeno indeseable y posiblemente fatal en las células eucariotas en las que el genoma se replica más de una vez por ciclo celular . [1] Se cree que la re-replicación conduce a la inestabilidad genómica y ha sido implicada en las patologías de una variedad de cánceres humanos . [2] Para prevenir la re-replicación, las células eucariotas han desarrollado múltiples mecanismos superpuestos para inhibir que el ADN cromosómico se re-replica parcial o totalmente en un ciclo celular dado. Estos mecanismos de control dependen de la actividad de la quinasa dependiente de ciclina (CDK). [1] Los mecanismos de control de la replicación del ADN cooperan para prevenir la re-licencia de los orígenes de replicación y para activar los puntos de control del ciclo celular y del daño del ADN . [2] La re-replicación del ADN debe ser regulada estrictamente para asegurar que la información genómica se transmita fielmente a través de generaciones sucesivas.
La replicación del ADN siempre comienza en un origen de replicación. En la levadura, los orígenes contienen secuencias de replicación autónoma (ARS), distribuidas por todo el cromosoma a unos 30 kb unas de otras. Permiten la replicación del ADN dondequiera que se coloquen. Cada una tiene una longitud de 100-200 pb, y el elemento A es uno de los tramos más conservados. Junto con otros elementos B conservados, forman la sección donde los complejos de reconocimiento del origen (ORC) se ensamblan para comenzar la replicación. La repetición de estas secuencias puede ser la más importante para el reconocimiento del origen.
En las células animales, los orígenes de replicación pueden parecer ubicados aleatoriamente a lo largo del cromosoma, a veces incluso actuando como ARS, pero la estructura local de la cromatina juega un papel importante en determinar dónde ocurrirá la replicación. Los orígenes de replicación no están distribuidos uniformemente a lo largo del cromosoma. Los grupos de replicones, que contienen entre 20 y 80 orígenes por grupo, se activan al mismo tiempo durante la fase S. Aunque todos se activan durante la fase S, la heterocromatina tiende a replicarse en la fase S tardía, ya que es más difícil acceder a ella que a la eucromatina. Los factores epigenéticos también tienen una gran influencia en lo que se replica y cuándo se replica. [3]
Todos los mecanismos conocidos que impiden la re-replicación del ADN en organismos eucariotas inhiben la concesión de licencias de origen. [1] La concesión de licencias de origen es el paso preliminar para la iniciación normal de la replicación durante la fase G1 tardía y la fase S temprana e implica el reclutamiento del complejo pre-replicativo (pre-RC) a los orígenes de replicación . La concesión de licencias comienza con la unión de la ATPasa multisubunidad , el complejo de reconocimiento de origen (ORC), al ADN en los orígenes de replicación. [4] Una vez unido a la cromatina , el ORC recluta la ATPasa AAA+ Cdc6 y la proteína de dominio de bobina superenrollada Cdt1 . La unión de Cdt1 y la actividad ATPasa de ORC y Cdc6 facilitan la carga de las proteínas de mantenimiento de minicromosomas (MCM) 2-7 en la cromatina. [1] El complejo MCM es la helicasa de ADN que abre la hélice en el origen de replicación y desenrolla las dos hebras a medida que las horquillas de replicación viajan a lo largo del ADN. [5] La actividad elevada de CDK al final de G1 desencadena la activación de los orígenes y el desmantelamiento de los pre-RC. Los altos niveles de CDK, que se mantienen hasta el final de la mitosis , inhiben o destruyen los componentes pre-RC y evitan que el origen vuelva a obtener la licencia. No se puede cargar un nuevo complejo MCM en el origen hasta que las subunidades pre-RC se reactiven con la disminución de la actividad de CDK al final de la mitosis. Por lo tanto, las CDK cumplen una doble función en la regulación de la replicación del ADN eucariota: la actividad elevada de CDK inicia la replicación en los orígenes y evita la re-replicación inhibiendo la renovación de la licencia del origen. [6] [7] [8] Esto garantiza que ningún origen de replicación se active dos veces en el mismo ciclo celular. [5]
Las primeras evidencias experimentales sobre la regulación de la replicación del ADN sugieren que los orígenes de replicación existen en uno de dos estados durante el ciclo celular: un estado prerreplicativo en G1 y un estado postreplicativo desde el momento de la iniciación hasta el paso por la mitosis. [1] Los orígenes de replicación alternan entre estos dos estados distintos durante el ciclo celular. [9] Un factor de licencia que se requiere para la iniciación de la replicación se une a los orígenes en el estado prerreplicativo. En la transición G1/S , el factor se inactiva y no se puede restaurar hasta que el ciclo celular haya concluido. [10] La identificación y caracterización de las proteínas ORC, Cdc6, Cdt1 y el complejo MCM como el factor de licencia da credibilidad a este modelo y sugiere un medio por el cual la naturaleza oscilatoria de las CDK en el ciclo celular puede regular la re-replicación. [1]
La regulación de la re-replicación se entiende mejor en la levadura en gemación. Las células de Saccharomyces cerevisiae previenen la re-replicación regulando directamente el ensamblaje de pre-RC a través de la fosforilación mediada por CDK de los componentes pre-RC Cdc6, MCM2-7 y las subunidades ORC. [5] La fosforilación de estos componentes se inicia al inicio de la fase S y se mantiene durante el resto del ciclo celular mientras la actividad de CDK permanece alta. El Cdc6 fosforilado se une a la ubiquitina-proteína ligasa SCF, lo que conduce a su degradación proteolítica . La fosforilación dependiente de CDK de las proteínas MCM2-7 da como resultado la exportación del complejo desde el núcleo . (Cdt1 que se asocia con el complejo MCM se exporta de manera similar desde el núcleo). La fosforilación de las subunidades ORC presumiblemente altera la capacidad del ORC para unirse a otros componentes pre-RC. [5] Por lo tanto, existen múltiples mecanismos que garantizan que el pre-RC no pueda reensamblarse en orígenes pos-replicativos.
Nota: Dado que los orígenes se activan en diferentes momentos a lo largo de la fase S, es fundamental que los mecanismos inhibidores que impiden el reclutamiento de nuevos MCM2-7 no desestabilicen los pre-RC existentes. Los pre-RC pueden permanecer ensamblados en orígenes que no se han activado, aunque los mecanismos inhibidores de la re-replicación estén inhibiendo o destruyendo los componentes de los pre-RC.
Aunque la regulación de CDK del ensamblaje de pre-RC parece estar altamente conservada evolutivamente , se observan algunas diferencias entre organismos. En eucariotas multicelulares, el ensamblaje de pre-RC está regulado por el complejo promotor de anafase (APC) además de CDK. APC, una enzima E3 , ubiquitina la proteína geminina y la dirige para su degradación. [5] La geminina normalmente previene la licencia de origen al unirse a Cdt1 e inhibirlo. En G1, la actividad de APC es adecuada para suprimir la acumulación de geminina, promoviendo así indirectamente el ensamblaje de pre-RC. Al final de G1, APC se inactiva y la geminina puede acumularse y prevenir la nueva licencia de origen.
La Cdt1 suele ser regulada positivamente por la activación transcripcional mediada por E2F y por la unión de la acetilasa humana a Orc1. La degradación proteolítica de Cdt1 es un mecanismo conservado también en varios eucariotas de orden superior. Cdt1 se degrada a través del complejo de ubiquitina ligasa Cul4–Ddb1–Cdt2 E3, de modo que el control de la autorización del ADN se mantiene en S y G2. Cdt1 es una proteína reguladora importante, y la evolución ha dado lugar a diferentes vías de regulación en diferentes organismos. La sobreexpresión de Cdt1 o la inactivación de Geminin pueden conducir a una nueva replicación, ya que Cdt1 no degradado inducirá el ensamblaje de pre-RC. [11]
La regulación pre-RC en la mayoría de los animales aún no se comprende bien. [5]
La re-replicación y el fallo mitótico no son generalmente eventos programados, sino que resultan espontáneamente de defectos en la maquinaria del ciclo celular. [1] La re-replicación parece dar lugar a roturas de dsADN que desencadenan una respuesta de daño del ADN y detienen las células en G2. [12] El punto de control causa efectivamente un arresto permanente del ciclo celular y una eventual apoptosis . [13]
La re-replicación puede inducirse experimentalmente alterando simultáneamente varios de los mecanismos que impiden la renovación de la licencia de origen. Por ejemplo, la desregulación de los mecanismos ORC, MCM2-7 y Cdc6 puede inducir la re-replicación en células de levadura en ciernes. [14]
Nota: La evidencia reciente sugiere que, aunque se superponen, los mecanismos de regulación de la replicación múltiple no deben considerarse funcionalmente redundantes; aunque un solo mecanismo puede reprimir la re-replicación con una eficiencia superior al 99%, puede no ser suficiente para mantener la estabilidad del genoma durante muchas generaciones. [15] En cambio, se cree [ ¿quién? ] que el efecto multiplicativo de muchos mecanismos superpuestos es lo que previene suficientemente la re-replicación y asegura la transmisión fiel del genoma de una célula .
Las células con estrés de replicación activan los puntos de control de replicación de modo que la fase S se retrasa y ralentiza la transición a la fase G2/M. Cuando el estrés replicativo es reconocido por las células U-2-OS, líneas celulares de osteosarcoma humano con retinoblastoma (RB) de tipo salvaje y p53, se activa la red de daño del ADN regulada por ATM/ATR. [16] Esta respuesta del punto de control se activa debido a la sobreexpresión de ciclina E, que ha demostrado ser importante en la regulación del sistema de licencias. [17] Cuando la ciclina E se sobreexpresa en líneas celulares U-2-OS, la red de daño del ADN regulada por ATM/ATR da como resultado aumentos en p53 fosforilada en Ser 15, γ-H2AX y cohesina SMC1 fosforilada en Ser 966. [16] La respuesta de re-replicación del ADN es diferente de la respuesta que se toma cuando el daño se debe a la generación de radicales de oxígeno. El daño causado por la generación de radicales de oxígeno conduce a una respuesta del oncogén Myc, que fosforila p53 y H2AX. [16]
La red de daño del ADN ATM/ATR también responderá a los casos en los que haya una sobreexpresión de Cdt1. La sobreexpresión de Cdt1 conduce a la acumulación de ssDNA y DSB. Ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3 (ATR) se activa antes cuando detecta ssDNA en las fases iniciales de la re-replicación del ADN. ATR fosforila factores de replicación posteriores, como RPA2 y MCM2 o mediante la modulación de Rb o p53. Ataxia telangiectasia mutada (ATM) se activa después de que se detecta una mayor cantidad de DSB en etapas posteriores de la re-replicación del ADN. Si bien ATM desempeña un papel en la detención del ciclo celular, la apoptosis y la senescencia, también se sospecha que desempeña un papel en la mediación de la reparación de DSB, pero aún no se comprenden los mecanismos exactos. [11]
La re-replicación se ha implicado en la tumorigénesis en organismos modelo y humanos . Las proteínas de iniciación de la replicación se sobreexpresan en muestras de tejido de varios tipos de cánceres humanos [1] [18] [19] y la sobreexpresión experimental de Cdt1 y Cdc6 puede causar el desarrollo de tumores en células de ratón. [20] [21] [22] De manera similar, se ha informado que la ablación de geminina en ratones knock out mejora la formación de tumores. [23] Además, estos estudios indican que la re-replicación puede resultar en un aumento de la aneuploidía , fusiones cromosómicas y roturas de ADN. [24] Una comprensión profunda de los mecanismos de replicación reguladores es importante para el desarrollo de nuevos tratamientos contra el cáncer.
En levaduras, el aumento de la actividad de la CDK G1 suele inhibir el ensamblaje de pre-RC y la entrada en la fase S con orígenes menos activos, pero en células cancerosas, las vías p53 y Rb/E2F están desreguladas y permiten la entrada en la fase S con una cantidad reducida de orígenes activos. Esto conduce a roturas de doble cadena en el ADN, aumento de la recombinación y ordenamientos cromosómicos incorrectos. El mecanismo por el cual se produce este daño aún no se conoce. Una posibilidad es que la activación reducida del origen conduzca a una replicación incompleta del ADN. Solo se observa una re-replicación significativa cuando se inhiben todas las vías reguladoras de CDK. [25]
En las células de mamíferos, Cdt1 y Cdc6 son mucho más importantes para la regulación de la re-replicación. [25] Se encontró una sobreexpresión de Cdt1 y Cdc6 en 43/75 casos de carcinomas de pulmón de células no pequeñas. [11] La selección de Cdc6 u ORC en células de mamíferos no causa una re-replicación sustancial. La sobreexpresión de Cdt1, por otro lado, puede conducir a niveles de re-replicación potencialmente letales por sí sola. Esta respuesta se observa solo en células cancerosas. [25] La sobreexpresión de miembros de la familia E2F contribuye a un aumento en la expresión de Cdt1 y Cdc6. La pérdida de la regulación de p53 en células también se puede observar con frecuencia en líneas celulares que sobreexpresan Cdt1 o Cdc6. [11]
Para el caso especial de la replicación de ADN regulada por el ciclo celular en el que la síntesis de ADN está desacoplada de la progresión del ciclo celular, consulte la endorreduplicación . La endorreduplicación es un mecanismo importante y generalizado en muchos tipos de células. No se adhiere a muchos de los puntos de control del ciclo celular y controles de daños en células que se dividen regularmente, pero no da como resultado una re-replicación descontrolada. La endorreduplicación es un proceso controlado y ocurre para realizar una función celular específica. En algunas células, se ha propuesto que la endorreduplicación se utiliza como una forma de almacenar nucleótidos para la embriogénesis y la germinación. En otros casos, la endorreduplicación puede usarse en células que solo se utilizan para el almacenamiento de nutrientes. A pesar de su funcionamiento útil en muchas células, la endorreduplicación también se ha observado en células cancerosas, y no se entiende completamente si la endorreduplicación conduce a un comportamiento canceroso o si otras mutaciones conducen a la endorreduplicación. Otros mecanismos pueden estar involucrados en la mediación de estos cambios. [26]