La microscopía fotoacústica es un método de obtención de imágenes basado en el efecto fotoacústico y es un subconjunto de la tomografía fotoacústica . La microscopía fotoacústica aprovecha el aumento de temperatura local que se produce como resultado de la absorción de luz en el tejido. Utilizando un haz de láser pulsado de nanosegundos , los tejidos experimentan una expansión termoelástica, lo que da como resultado la liberación de una onda acústica de banda ancha que se puede detectar utilizando un transductor de ultrasonidos de alta frecuencia . [1] Dado que la dispersión ultrasónica en el tejido es más débil que la dispersión óptica, la microscopía fotoacústica es capaz de lograr imágenes de alta resolución a mayores profundidades que los métodos de microscopía convencionales. Además, la microscopía fotoacústica es especialmente útil en el campo de la obtención de imágenes biomédicas debido a su escalabilidad. Al ajustar los focos ópticos y acústicos, se puede optimizar la resolución lateral para la profundidad de imagen deseada. [2]
El objetivo de la microscopía fotoacústica es encontrar el aumento de presión local , que se puede utilizar para calcular el coeficiente de absorción según la fórmula:
donde es el porcentaje de luz convertida en calor, es la fluencia óptica local (J/cm 2 ), y el parámetro de Gruneisen adimensional se define como:
donde es el coeficiente térmico de expansión de volumen (K −1 ), es la compresibilidad isotérmica (Pa −1 ), y es la densidad (kg/m 3 ). [3]
Tras el aumento de presión inicial, una onda fotoacústica se propaga a la velocidad del sonido dentro del medio y puede detectarse con un transductor de ultrasonidos.
Una de las principales ventajas de la microscopía fotoacústica es la simplicidad de la reconstrucción de imágenes. Un pulso láser excita el tejido en dirección axial y las ondas fotoacústicas resultantes son detectadas por un transductor de ultrasonidos . A continuación, el transductor convierte la energía mecánica en una señal de voltaje que puede leerse mediante un convertidor analógico a digital para su posprocesamiento. Como resultado de cada pulso láser se forma una imagen unidimensional, conocida como línea A. La transformada de Hilbert de una línea A revela información codificada en profundidad. A continuación, se puede formar una imagen fotoacústica 3D combinando múltiples líneas A producidas por escaneo de trama 2D. [3]
La modificación de los retardos de los elementos de un transductor de ultrasonidos permite enfocar las ondas de ultrasonidos de forma similar a como pasan a través de una lente acústica. Este método de retardo y suma permite encontrar la señal en cada punto focal. Sin embargo, la resolución lateral está limitada por la presencia de lóbulos laterales , que aparecen en ángulos polares y dependen del ancho de cada elemento. [4]
En las modalidades de obtención de imágenes fotoacústicas, incluida la microscopía fotoacústica, el contraste se basa en la excitación de fotones y, por lo tanto, está determinado por las propiedades ópticas del tejido. Cuando un electrón absorbe un fotón, pasa a un estado de mayor energía. Al regresar a un nivel de energía más bajo, el electrón experimenta una relajación radiativa o no radiativa. Durante la relajación radiativa, el electrón libera energía en forma de fotón. Por otro lado, un electrón que experimenta una relajación no radiativa libera energía en forma de calor. El calor induce un aumento de presión que se propaga como una onda fotoacústica. Debido al hecho de que casi todas las moléculas son capaces de una relajación no radiativa, la microscopía fotoacústica tiene el potencial de obtener imágenes de una amplia gama de agentes endógenos y exógenos. Por el contrario, menos moléculas son capaces de una relajación radiativa, lo que limita las técnicas de microscopía de fluorescencia, como la microscopía de un fotón y de dos fotones . [3] La investigación actual en microscopía fotoacústica aprovecha los agentes de contraste endógenos y exógenos para obtener información funcional sobre el cuerpo, desde los niveles de saturación sanguínea hasta la tasa de proliferación del cáncer.
Los agentes de contraste endógenos, moléculas que se encuentran de forma natural en el organismo, son útiles en la microscopía fotoacústica debido a que se pueden visualizar de forma no invasiva. Los agentes endógenos tampoco son tóxicos y no afectan las propiedades del tejido que se estudia. En particular, los absorbentes endógenos se pueden clasificar en función de sus longitudes de onda de absorción. [2]
Dentro del rango de luz ultravioleta (λ = 180 a 400 nm), el principal absorbente en el cuerpo es el ADN y el ARN . Mediante el uso de microscopía fotoacústica ultravioleta, se pueden obtener imágenes del ADN y el ARN en los núcleos celulares sin el uso de marcado de fluorescencia. Dado que el cáncer está asociado con la falla de replicación del ADN , la microscopía fotoacústica UV tiene el potencial de usarse para la detección temprana del cáncer. [5]
Los absorbentes de luz visible (λ = 400 a 700 nm) incluyen oxihemoglobina , desoxihemoglobina , melanina y citocromo c . La microscopía fotoacústica de luz visible es particularmente útil para determinar la concentración de hemoglobina y la saturación de oxígeno debido a la diferencia en los perfiles de absorción de oxihemoglobina y desoxihemoglobina. El análisis en tiempo real se puede utilizar para determinar la velocidad del flujo sanguíneo y la tasa de metabolismo del oxígeno. [3] Además, la microscopía fotoacústica es capaz de detectar el melanoma de forma temprana debido a la alta concentración de melanina que se encuentra en las células del cáncer de piel.
Los absorbentes del infrarrojo cercano (λ = 700 a 1400 nm) incluyen agua, lípidos y glucosa. La determinación fotoacústica de los niveles de glucosa en sangre se puede utilizar para tratar la diabetes, mientras que el estudio de las concentraciones de lípidos dentro de los vasos sanguíneos es importante para controlar la progresión de la aterosclerosis . [2] Todavía es posible cuantificar y comparar las concentraciones de desoxihemoglobina y hemoglobina en esta longitud de onda, intercambiando una penetración tisular más profunda por una absorción menor. [6]
Aunque los agentes de contraste endógenos no son invasivos y son más sencillos de utilizar, están limitados por su comportamiento y concentración inherentes, lo que dificulta el seguimiento de ciertos procesos si la absorción óptica es débil. Por otro lado, los agentes exógenos pueden diseñarse para que se unan específicamente a ciertas moléculas de interés. Además, la concentración de agentes exógenos puede optimizarse para producir una mayor señal y proporcionar más contraste. A través de la unión selectiva, los agentes de contraste exógenos son capaces de dirigirse a moléculas de interés específicas y, al mismo tiempo, mejorar las imágenes resultantes. [3]
Los colorantes orgánicos, como el ICG -PEG y el azul de Evans , se utilizan para mejorar la vasculatura y la obtención de imágenes de tumores. Además, los colorantes se filtran fácilmente del cuerpo debido a su pequeño tamaño (≤ 3 nm). [2]
Actualmente, se están realizando investigaciones sobre las nanopartículas debido a su inactividad química y su capacidad para atacar las células tumorales. Estas propiedades permiten controlar la propagación del cáncer y, potencialmente, permiten su eliminación intraoperatoria. Sin embargo, se necesitan más estudios sobre los efectos de toxicidad a corto plazo para determinar si las nanopartículas son adecuadas para la investigación clínica. [2] Las nanopartículas de oro han demostrado ser prometedoras como agente de contraste para la medicina guiada por imágenes. Las nanopartículas de oro se han utilizado ampliamente como agentes de contraste debido a su fuerte y ajustable absorción óptica. [7]
Las proteínas fluorescentes se han desarrollado para la obtención de imágenes mediante microscopía de fluorescencia y son únicas porque pueden codificarse genéticamente y, por lo tanto, no es necesario administrarlas al cuerpo. Mediante la microscopía fotoacústica, las proteínas fluorescentes se pueden visualizar a profundidades que van más allá del límite de los métodos de microscopía típicos. [2] La atenuación acústica dependiente de la frecuencia en el tejido y la atenuación de las frecuencias más altas limitan el ancho de banda de propagación de la luz a través de regiones más profundas del tejido. Las proteínas fluorescentes actúan como fuente de luz en la región objetivo, evitando la limitación de la atenuación óptica. Sin embargo, la eficacia de las proteínas fluorescentes está limitada por los cambios bajos de fluencia , ya que la ecuación de difusión de la luz predice un aumento inferior al 5 %. [8]
La microscopía fotoacústica consigue una mayor penetración que la microscopía convencional gracias a la detección ultrasónica. Como resultado, la resolución axial se define acústicamente y se determina mediante la fórmula:
donde es la velocidad del sonido en el medio y es el ancho de banda de la señal fotoacústica. La resolución axial del sistema se puede mejorar utilizando un transductor de ultrasonidos con un ancho de banda más amplio, siempre que el ancho de banda coincida con el de la señal fotoacústica. La resolución lateral de la microscopía fotoacústica depende de los focos ópticos y acústicos del sistema. La microscopía fotoacústica de resolución óptica (OR-PAM) utiliza un enfoque óptico más ajustado que el enfoque acústico, mientras que la microscopía fotoacústica de resolución acústica (AR-PAM) utiliza un enfoque acústico más ajustado que el enfoque óptico. [9] [10]
Debido a un enfoque óptico más estrecho, OR-PAM es más útil para obtener imágenes en el rango cuasi balístico de profundidades de hasta 1 mm. [9] La resolución lateral de OR-PAM está determinada por la fórmula:
donde es la longitud de onda óptica y es la apertura numérica de la lente del objetivo óptico. [2] La resolución lateral de OR-PAM se puede mejorar utilizando un pulso láser más corto y un enfoque más preciso del punto láser. Los sistemas OR-PAM normalmente pueden lograr una resolución lateral de 0,2 a 10 μm, lo que permite clasificar a OR-PAM como un método de obtención de imágenes de súper resolución .
A profundidades superiores a 1 mm y hasta 3 mm, la microscopía fotoacústica de resolución acústica (AR-PAM) es más útil debido a una mayor dispersión óptica. La dispersión acústica es mucho más débil más allá del límite de difusión óptica, lo que hace que la AR-PAM sea más práctica, ya que proporciona una mayor resolución lateral a estas profundidades. La resolución lateral de la AR-PAM se determina mediante la fórmula:
donde es la longitud de onda central de la onda fotoacústica y es la apertura numérica del transductor de ultrasonidos. [2] Por lo tanto, se puede lograr una resolución lateral más alta aumentando la frecuencia central del transductor de ultrasonidos y un enfoque acústico más ajustado. Los sistemas AR-PAM normalmente pueden lograr una resolución lateral de 15 a 50 μm.
Al ignorar la luz balística , la microscopía fotoacústica confocal de campo oscuro reduce la señal de la superficie. Este método utiliza un láser pulsado de campo oscuro y detección ultrasónica de alta apertura numérica, con el extremo de salida de la fibra alineado coaxialmente con el transductor de ultrasonido enfocado. La filtración de la luz balística se basa en la forma alterada del haz láser de excitación en lugar de un disco opaco, como se utiliza en la microscopía de campo oscuro convencional . La técnica de reconstrucción general se utiliza para convertir la señal fotoacústica en una línea A, y las imágenes de la línea B se producen mediante escaneo de trama. [4]
La microscopía fotoacústica tiene una amplia gama de aplicaciones en el campo biomédico. Debido a su capacidad para obtener imágenes de una variedad de moléculas en función de la longitud de onda óptica, la microscopía fotoacústica se puede utilizar para obtener información funcional sobre el cuerpo de forma no invasiva. La dinámica del flujo sanguíneo y las tasas metabólicas de oxígeno se pueden medir y correlacionar con estudios de aterosclerosis o proliferación tumoral. Se pueden utilizar agentes exógenos para unirse al tejido canceroso, mejorando el contraste de la imagen y ayudando en la extirpación quirúrgica. En la misma línea, la microscopía fotoacústica es útil en el diagnóstico temprano del cáncer debido a la diferencia en las propiedades de absorción óptica en comparación con el tejido sano. [1]
