La microscopía de espectro de fuerza (FSM) es una aplicación de la microrreología activa desarrollada para medir fuerzas aleatorias agregadas en el citoplasma . [1] Se inyectan trazadores de flujo grandes e inertes en células vivas y se alojan dentro de la malla citoesquelética , donde oscilan por repercusiones de proteínas motoras activas. La magnitud de estas fuerzas aleatorias se puede inferir a partir de la frecuencia de oscilación de las partículas trazadoras. El seguimiento de las fluctuaciones de las partículas trazadoras mediante microscopía óptica puede aislar la contribución de las fuerzas aleatorias activas al transporte molecular intracelular de la del movimiento browniano .
FSM fue desarrollado por Ming Guo y David A. Weitz para investigar las fuerzas intracelulares estocásticas generadas por las proteínas motoras. [1] Lejos de un vacío líquido, el citoplasma contiene una red compleja de actina y miosina que confieren soporte estructural a la célula, además de albergar vesículas y mitocondrias entre otros orgánulos. [2] Investigaciones recientes sobre el hacinamiento macromolecular dentro del citoplasma plantean inquietudes sobre si el movimiento de tipo difusivo de moléculas grandes se ha atribuido erróneamente a fuerzas brownianas. [3] En cambio, existen sospechas de que las proteínas motoras de miosina , que tiran aleatoriamente de los filamentos de actina incrustados con moléculas grandes, dan lugar a un movimiento de tipo difusivo de las moléculas dentro de las células. [3] [4] Guo et al. desarrollaron un ensayo para distinguir si el movimiento de partículas dentro de las células es impulsado por la difusión térmica o por repercusiones de proteínas motoras activas como la miosina II no muscular que sacude el citoesqueleto celular.
La FSM se basa en la inyección de partículas trazadoras recubiertas de polietilenglicol (PEG) de un tamaño mayor que el tamaño de la malla del citoesqueleto (>50 nm), [5] que se asientan entre una red de filamentos de actina y proteínas motoras de miosina. A medida que las proteínas motoras de miosina tiran de los filamentos de actina para realizar el trabajo celular, estas fluctuaciones de actina invariablemente hacen oscilar las partículas PEGiladas vecinas. La magnitud de la fluctuación del trazador es proporcional a la magnitud de las fuerzas motoras activas agregadas. Por lo tanto, al registrar el desplazamiento de las oscilaciones del trazador, la FSM puede medir y derivar la magnitud de las fuerzas ejercidas por las proteínas motoras activas. [1]
Las fluctuaciones de los trazadores PEGilados acoplados a las fuerzas motoras de la miosina agregada pueden compararse con un resorte de Hooke ,
donde la fuerza aplicada para generar el desplazamiento de oscilación es proporcional a la constante de resorte efectiva del entorno intracelular. El desplazamiento durante la oscilación es una función espacial del tiempo, que se puede medir directamente utilizando microscopía óptica. [1] Luego, una transformada de Fourier asigna información en el dominio temporal al dominio de frecuencia para derivar una dimensión útil en función de la frecuencia.
donde , y son formas cuadráticas de fuerza, elasticidad y desplazamiento promediados que se utilizan para explicar las fuerzas estocásticas. [1] El desplazamiento cuadrático medio promediado en el tiempo , se puede recuperar mediante una transformada de Fourier desde el dominio de frecuencia hasta el dominio temporal. En el contexto de la frecuencia de oscilación, cuanto mayor sea el espectro de frecuencia de fuerza, mayor será la actividad metabólica de la célula. [6] Las mediciones micromecánicas independientes pueden calcular la elasticidad del citoplasma. Al usar una pinza óptica para aplicar una fuerza prescrita a una partícula trazadora, FSM puede medir el desplazamiento resultante para estimar la constante elástica del resorte. [7] [8]
La oscilación dirigida de partículas trazadoras utilizando pinzas ópticas resultó en un desplazamiento que estaba casi sincronizado con la fuerza aplicada, lo que sugiere que el citoplasma está materialmente más cerca de un sólido elástico. [1] Esto está en marcado contraste con la hipótesis anterior de que el citoplasma es un fluido viscoelástico en el que las moléculas grandes pueden difundirse libremente. [9] En células agotadas de ATP , en las que la miosina II no muscular está inactivada, los experimentos FSM revelan que las partículas trazadoras dejan de oscilar como si el citoplasma se hubiera solidificado. [1] Las miosinas II son proteínas motoras que se unen y tiran de los filamentos de actina a través de la hidrólisis de ATP. [10] Esto corrobora aún más el hallazgo de que en las bacterias hambrientas de nutrientes , el citoplasma se transforma en una sustancia similar al vidrio. [11] Por lo tanto, la hidrólisis de ATP por proteínas motoras parece ser fundamental para mantener la fluidez citoplasmática, que es crucial para el transporte de vesículas y el movimiento difusivo en el citoesqueleto. [1]
Al medir el estado general de actividad dentro de una célula, la FSM se puede aplicar para identificar células cancerosas malignas , que son característicamente más elásticas [12] y más móviles. Las mediciones de FSM en células de cáncer de mama maligno MCF-7 y células de cáncer de mama benigno MCF-10A revelaron una separación estadísticamente significativa en el espectro de fuerza que permite que la FSM analice el cáncer metastásico . [1] La dimensionalidad del entorno extracelular influye en gran medida en las mediciones de FSM de las células cancerosas. En una matriz 3D, las células de cáncer de mama metastásico MDA-MB-231 tenían un citoplasma comparativamente más sólido que sus contrapartes cultivadas en placas 2D. [13]
