La edición o ingeniería del epigenoma es un tipo de ingeniería genética en la que el epigenoma se modifica en sitios específicos utilizando moléculas diseñadas específicamente para esos sitios (en lugar de modificaciones del genoma completo). Mientras que la edición genética implica cambiar la secuencia de ADN en sí, la edición epigenética implica modificar y presentar secuencias de ADN a proteínas y otros factores de unión al ADN que influyen en la función del ADN. Al "editar" características epigenómicas de esta manera, los investigadores pueden determinar el papel biológico exacto de una modificación epigenética en el sitio en cuestión.
Las proteínas diseñadas que se utilizan para la edición del epigenoma se componen de un dominio de unión al ADN que se dirige a secuencias específicas y un dominio efector que modifica las características epigenómicas. En la actualidad, se han utilizado predominantemente tres grupos principales de proteínas de unión al ADN para la edición del epigenoma: proteínas con dedos de zinc , efectores similares a activadores de la transcripción (TALE) y fusiones Cas9 deficientes en nucleasas ( CRISPR ).
La comparación de los mapas epigenéticos de todo el genoma con la expresión génica ha permitido a los investigadores asignar funciones activadoras o represoras a modificaciones específicas. La importancia de la secuencia de ADN en la regulación del epigenoma se ha demostrado mediante el uso de motivos de ADN para predecir la modificación epigenómica. [1] Se han obtenido más conocimientos sobre los mecanismos detrás de la epigenética a partir de análisis bioquímicos y estructurales in vitro . Utilizando organismos modelo , los investigadores han podido describir el papel de muchos factores de la cromatina a través de estudios de knockout . Sin embargo, la eliminación de un modificador de cromatina completo tiene efectos masivos en todo el genoma, que puede no ser una representación precisa de su función en un contexto específico. Como un ejemplo de esto, la metilación del ADN ocurre en regiones de repetición , promotores , potenciadores y cuerpos de genes . Aunque la metilación del ADN en los promotores de genes generalmente se correlaciona con la represión génica, la metilación en los cuerpos de los genes se correlaciona con la activación génica, y la metilación del ADN también puede desempeñar un papel en el empalme génico. [2] La capacidad de dirigirse directamente a sitios de metilación individuales y editarlos es fundamental para determinar la función exacta de la metilación del ADN en un sitio específico. La edición del epigenoma es una herramienta poderosa que permite este tipo de análisis. Para la edición de la metilación del ADN en sitios específicos, así como para la edición de histonas, los sistemas de edición del genoma se han adaptado a los sistemas de edición epigénica. En resumen, las proteínas homing del genoma con funciones de nucleasa diseñadas o naturales para la edición genética, se pueden mutar y adaptar a sistemas puramente de administración. Una enzima o dominio modificador epigenético se puede fusionar a la proteína homing y las modificaciones epigenéticas locales se pueden alterar tras el reclutamiento de la proteína. Excepcionalmente para la metilación del ADN , el dominio homing en sí mismo puede ser suficiente para interferir con los procesos epigenéticos normales y conducir a una edición epigenética dirigida. [3]
La proteína Efectora de Tipo Activador de la Transcripción (TALE) reconoce secuencias de ADN específicas en función de la composición de su dominio de unión al ADN . [4] Esto permite al investigador construir diferentes proteínas TALE para reconocer una secuencia de ADN objetivo editando la estructura proteica primaria de TALE. La especificidad de unión de esta proteína se confirma típicamente utilizando inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y secuenciación de Sanger del fragmento de ADN resultante. [5] [6] [7] Esta confirmación todavía es necesaria en todas las investigaciones de reconocimiento de secuencias TALE. [8] Cuando se utilizan para la edición del epigenoma, estas proteínas de unión al ADN se unen a una proteína efectora. Las proteínas efectoras que se han utilizado para este propósito incluyen la metilcitosina dioxigenasa 1 de translocación diez-once (TET1) , [6] la desmetilasa 1A específica de lisina (K) (LSD1) [7] y la proteína 1 de unión al calcio y la integrina (CIB1) . [5]
También se ha explorado el uso de proteínas de fusión con dedos de zinc para reconocer sitios para la edición del epigenoma. Maeder et al. han construido una proteína ZF-TET1 para su uso en la desmetilación del ADN. [6] Estas proteínas con dedos de zinc funcionan de manera similar a las proteínas TALE en el sentido de que pueden unirse a sitios específicos de la secuencia en el ADN en función de su estructura proteica, que puede modificarse. Chen et al. han utilizado con éxito un dominio de unión al ADN con dedos de zinc acoplado a la proteína TET1 para inducir la desmetilación de varios genes previamente silenciados. [9] Kungulovski y Jeltsch utilizaron con éxito la deposición guiada por ZFP del gen de metilación del ADN para provocar el silenciamiento del gen, pero la metilación y el silenciamiento del ADN se perdieron cuando se detuvo la señal desencadenante. Los autores sugieren que para que se produzcan cambios epigenéticos estables, debe haber múltiples deposiciones de metilación del ADN de marcas epigenéticas relacionadas o estímulos desencadenantes de larga duración. [10] La edición epigenética con ZFP ha demostrado tener potencial para tratar varias enfermedades neurodegenerativas. [11]
El sistema Cas de repetición palindrómica corta interespaciada y agrupada (CRISPR) funciona como una nucleasa específica del sitio de ADN. [12] En el sistema CRISPR tipo II, bien estudiado, la nucleasa Cas9 se asocia con una quimera compuesta de ARNtracr y ARNcr. Esta quimera se conoce con frecuencia como ARN guía (ARNg). Cuando la proteína Cas9 se asocia con un ARNg específico de la región de ADN, Cas9 escinde el ADN en los loci de ADN objetivo. Sin embargo, cuando se introducen las mutaciones puntuales D10A y H840A, se genera una Cas9 catalíticamente muerta (dCas9) que puede unirse al ADN pero no lo escinde. [13] El sistema dCas9 se ha utilizado para la reprogramación epigenética dirigida con el fin de introducir la metilación del ADN en el sitio específico. Al fusionar el dominio catalítico DNMT3a con la proteína dCas9, dCas9-DNMT3a es capaz de lograr la metilación de ADN dirigida de una región específica como se especifica en el ARN guía actual. [14] De manera similar, dCas9 se ha fusionado con el núcleo catalítico de la acetiltransferasa humana p300 . dCas9-p300 cataliza con éxito la acetilación dirigida de la lisina 27 de la histona H3. [15] [16] Alternativamente, la proteína dCas9 por sí sola es suficiente para interferir físicamente con los procesos normales que mantienen la metilación del ADN en el sitio al que se dirige en las células en división; esto da como resultado una desmetilación de ADN dirigida. El beneficio principal de este enfoque es que está libre de enzimas modificadoras epigenéticas, que pueden afectar las marcas epigenéticas a grandes distancias y actuar de forma independiente en todo el genoma a pesar de estar unidas a una proteína dCas9 específica, lo que a menudo conduce a efectos generalizados fuera del objetivo. [3]
Una variante en la edición del epigenoma mediante CRISPR (llamada FIRE-Cas9) permite revertir los cambios realizados, en caso de que algo haya salido mal. [17] [18]
CRISPRoff es una proteína de fusión Cas9 muerta que se puede utilizar para silenciar de forma hereditaria la expresión genética de "la mayoría de los genes" y permite modificaciones reversibles. [19] [20]
TET1 induce la desmetilación de la citosina en los sitios CpG . Esta proteína se ha utilizado para activar genes que son reprimidos por la metilación de CpG y para determinar el papel de los sitios de metilación de CpG individuales. [6] Se cree ampliamente que la desmetilación dirigida se logra típicamente mejor solo con dCas9 (por interferencia dirigida con la maquinaria normal de metilación del ADN) ya que la introducción de dCas9-TET en las células conduce a una actividad generalizada fuera del objetivo de la enzima TET sobreexpresada. [3] LSD1 induce la desmetilación de H3K4me1 /2, que también causa un efecto indirecto de desacetilación en H3K27. Este efector se puede utilizar en histonas en regiones potenciadoras, que pueden cambiar la expresión de genes vecinos. [7] CIB1 es un criptocromo sensible a la luz , este criptocromo está fusionado a la proteína TALE. Una segunda proteína contiene un socio de interacción ( CRY2 ) fusionado con un modificador de cromatina / ADN (p. ej. SID4X). CRY2 es capaz de interactuar con CIB1 cuando el criptocromo ha sido activado por iluminación con luz azul. [21] La interacción permite que el modificador de la cromatina actúe en la ubicación deseada. Esto significa que la modificación puede realizarse de manera inducible y reversible, lo que reduce los efectos secundarios a largo plazo que serían causados por la modificación epigenética constitutiva. [5]
Mendenhall et al. (2013) han demostrado la edición de regiones potenciadoras de genes en el genoma mediante modificación epigenética dirigida. [7] En este estudio se utilizó una proteína de fusión efectora TALE-LSD1 para dirigirse a potenciadores de genes, inducir el silenciamiento de potenciadores y deducir la actividad potenciadora y el control de genes. La selección de potenciadores específicos seguida de una RT-qPCR específica de locus permite determinar los genes afectados por el potenciador silenciado. Alternativamente, inducir el silenciamiento de potenciadores en regiones situadas aguas arriba de los genes permite alterar la expresión génica. La RT-qPCR puede utilizarse entonces para estudiar los efectos de esto en la expresión génica. Esto permite estudiar en detalle la función y la actividad de los potenciadores. [7]
Es importante comprender el papel que desempeñan los sitios de metilación específicos en la regulación de la expresión génica. Para estudiar esto, un grupo de investigación utilizó una proteína de fusión TALE-TET1 para desmetilar un único sitio de metilación de CpG. [6] Aunque este enfoque requiere muchos controles para garantizar la unión específica a los loci objetivo, un estudio realizado correctamente utilizando este enfoque puede determinar la función biológica de un sitio de metilación de CpG específico. [6]
La edición epigenética mediante un mecanismo inducible ofrece una amplia gama de usos potenciales para estudiar los efectos epigenéticos en varios estados. Un grupo de investigación empleó un sistema optogenético de doble híbrido que integraba el dominio de unión al ADN TALE específico de la secuencia con una proteína criptocromo 2 sensible a la luz ( CIB1 ). [5] Una vez expresado en las células, el sistema fue capaz de editar de forma inducible las modificaciones de las histonas y determinar su función en un contexto específico. [5]
La regulación dirigida de genes relacionados con enfermedades puede permitir nuevas terapias para muchas enfermedades, especialmente en casos en los que aún no se han desarrollado terapias genéticas adecuadas o son inadecuadas. [22] Si bien las consecuencias transgeneracionales y a nivel poblacional no se comprenden por completo, puede convertirse en una herramienta importante para la genómica funcional aplicada y la medicina personalizada . [23] Al igual que con la edición de ARN , no implica cambios genéticos y sus riesgos acompañantes. [22] En 2021 se describió un ejemplo de un posible uso funcional de la edición del epigenoma: la represión de la expresión del gen Na v 1.7 a través de CRISPR-dCas9 , que mostró potencial terapéutico en tres modelos de ratón de dolor crónico. [24] [25]
En 2022, una investigación evaluó su utilidad para reducir los niveles de proteína tau , regular una proteína involucrada en la enfermedad de Huntington , atacar una forma hereditaria de obesidad y el síndrome de Dravet . [26]
La especificidad de la secuencia es de importancia crítica en la edición del epigenoma y debe verificarse cuidadosamente (esto se puede hacer usando inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación de Sanger para verificar la secuencia objetivo). [8] Se desconoce si la fusión de TALE puede causar efectos en la actividad catalítica del modificador del epigenoma. Esto podría ser especialmente importante en proteínas efectoras que requieren múltiples subunidades y complejos como el complejo represor Polycomb . [8] Las proteínas utilizadas para la edición del epigenoma también pueden obstruir ligandos y sustratos en el sitio objetivo. [8] La proteína TALE en sí misma puede incluso competir con factores de transcripción si están dirigidos a la misma secuencia. [8] Además, los sistemas de reparación del ADN podrían revertir las alteraciones en la cromatina y evitar que se realicen los cambios deseados. [8] Finalmente, las enzimas fusionadas a dCas9 normalmente pueden actuar independientemente de la proteína dCas9 a la que están fusionadas. Cuando estas fusiones se sobreexpresan en las células, estas enzimas tienden a modificar grandes porciones del genoma en lo que constituye una dramática actividad fuera del objetivo. [3] [27] Por lo tanto, es necesario que las construcciones de fusión y los mecanismos de focalización se optimicen para una edición del epigenoma confiable y repetible.